克唑替尼对非小细胞肺癌细胞放射增敏作用的研究

【摘要】目的 观察体外环境下克唑替尼对NSCLC细胞的放射增敏效果及其潜在机制。方法 以H2228及H3122细胞株为实验对象，MTT法检测不同浓度克唑替尼对NSCLC细胞的抑制作用；平板克隆形成实验分别测定NSCLC细胞在克唑替尼作用下照射以及单纯照射的SF，拟合细胞生存曲线并计算放射增敏比；流式细胞仪检测各细胞株的接受不同剂量放射线后细胞凋亡率及细胞周期分布的变化；Western Blot检测各细胞株接受放射线照射后STAT3及p-STAT3蛋白表达水平变化。结果 MTT实验：抑制率与浓度变化呈正相关。IC50分别为330 nM和102 nM。克隆形成实验：附加药物照射的细胞SF低于单纯照射组。H2228/ H3122细胞株组中，SER（D0）：1.064/1.004；SER（Dq）：1.079/1.047。流式细胞术：两细胞的凋亡率与照射剂量呈正比。在H2228组细胞中G0/G1期细胞阻滞现象明显，H3122细胞各周期细胞比率未见明显变化。Western Blot法：应用克唑替尼联合时STAT3的磷酸化过程受到阻滞。H2228细胞株阻滞现象更为明显。结论 克唑替尼对NSCLC H2228及H3122细胞株均有放射增敏作用，对H2228细胞株的放射增敏效果更加明显。

【文献标识码】B

【文章编号】1674-9308（2015）04-0196-02

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.04.169

作者单位：450001郑州大学基础医学院放射医学教研室

The Study of Radiosensitization of Crizotinib on Cells in Non-small Cell Lung Cancer

YANG Wenkui JIAGN Wenhan LI Dianyuan, Basic Medical College of Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China

[Abstract] Objective To observe the radiosensitization of crizotinib on NSCLC cells in vitro and to explore the potential mechanisms. Methods NSCLC cell lines H2228 and H3122 were used in this study. MTT was used to investigate the cytotoxicity of crizotinib and define the IC50 for H2228 and H3122 cells. Clonogenic assay was used to determine cell SF of cells received radiation alone and crizotinib administrated for 36 h before irradiation, fitting cell survival curve and calculating the ratio radiosensitization. Flow cytometry was used to detect the cell lines of different doses of radiation to accept change rate of apoptosis and cell cycle distribution. Western Blotting was used to detect STAT3 and p-STAT3 protein levels of cell lines after irradiation. Results The inhibition rate was positively related with the concentration change. The IC50 concentration of crizotinib were 330 nM and 102 nM. In the H2228/ H3122 cell group, SER (D0) were: 1.064/1.004, SER (Dq) were: 1.079/1.047. H2228 cells after the application of crizotinib, G0/G1 phase cell cycle arrest phenomenon obviously. H3122 cells for application the crizotinib after each cycle the cells did not change the ratio. Conclusion The crizotinib in non-small cell lung cancer cell lines H2228 and H3122 was radiosensitizing effect, the radiosensitizing effect on the H2228 cell line was more obvious.

[Key words] Crizotinib, H2228, H3122, Apoptosis, Radiosensitizer, STAT3, P-STAT3

肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤，也是恶性肿瘤死亡的主要原因，其中以非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）为主，占所有类型的80%～85%，Ⅰ、Ⅱ期及Ⅲa期（非N2患者）的NSCLC能够行根治性切除术 [1]。EML4-ALK融合基因的表达与非小细胞癌的发生、发展密切相关，已经成为NSCLC分子靶向治疗领域的研究热点 [2]。克唑替尼（Crizotinib）是口服型三磷酸腺苷竞争性抑制剂，本研究只要目的是观察体外环境下克唑替尼对NSCLCH3122及H2228细胞株的放射增敏效果及其潜在机制。

1　材料与方法

1.1　材料

EML4-ALK融合基因阳性的H2228细胞株及H3122细胞株购自南京科佰生物科技有限公司；RPMI-1640完全培养液及优级胎牛血清均购自北京索莱宝科技有限公司；克唑替尼购自Selleckchem公司；MTT购自 北京索莱宝科技有限公司；抗p-STAT兔单克隆抗体、抗STAT兔单克隆抗体及HRP-山羊抗兔IgG均购自Cell Signaling Technology公司。

1.2　细胞培养

使用含有10%优级胎牛血清的RPMI-1640完全培养液，置于培养箱培养；0.25%胰酶消化、传代；取对数生长的细胞进行试验。

1.3　MTT试验

取指数生长期的细胞株消化后加入培养基配置成细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100 µl。将96孔板分为上下两个区，4个重复孔。培养24 h加入MTT溶液继续培养4 h再加入DMSO，震荡后放置到酶标仪中，记录570 nm波长处的吸光度。生长抑制率（IR）＝1－（药物作用组OD值/空白对照组OD值）×100%，计算出克唑替尼对两细胞株的IC50值。

1.4　克隆形成实验

采用两细胞株的50%IC50值为后续的实验药物浓度。单纯药物组在加入药物后继续孵育72 h后，更换新鲜培养基，继续培养24 h，当培养板中出现肉眼可见细胞群落时，弃培养液。照射组选择0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy的放射线下进行照射，照射后继续培养24 h，观察细胞群落的形成。应用Sigmaplot软件绘制剂量效应曲线，构建多靶单击模型，Dq = D0×1 nN 来拟合存活曲线，计算SER。

1.5　流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期分布情况

取生长状态良好的对数生长期H2228与H3122细胞，用RPMI-1640培养基稀释成10 6个/ml的细胞悬液，各自分为四组进行相应的处理，以细胞凋亡试剂盒和周期试剂盒说明书收集细胞并染色后用流式细胞术测定细胞凋亡率和周期分布。

1.6　Western Blotting检测STAT3及p-STAT3蛋白的表达

收集长满瓶的H3122及H2228细胞，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，所得总蛋白经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳转移至PVDF膜上，将一抗（抗STAT兔单克隆抗体或抗p-STAT兔单克隆抗体）用TBST稀释至适当浓度，并将封闭好的PVDF膜放入一抗稀释液中，过夜4℃下孵育，用同样的方法孵育二抗（HRP-山羊抗兔IgG）1 h。以β-actin作内参照，红外荧光Ⅱ抗显色，分析条带以灰度确定蛋白表达。

1.7　统计学方式

本实验数据采用SPSS13.0统计分析软件进行检验， P＜0.05认为差异有统计学意义。图像处理应用ImageJ2x及SigmaPlot10.0软件。

2　结果

2.1　对H3122及H2228细胞株的生长抑制作用

MTT实验结果显示，当克唑替尼浓度分别为0～1 600 nM时，作用于H2228细胞24 h后，增殖抑制率分别是：2.89%，21.03%，34.09%，43.36%，60.75%，68.54%，84.02%，抑制率与浓度变化呈正相关，IC50浓度为330 nM。作用于H3122细胞24 h后，增殖抑制率分别是：23.17%，37.98%，49.80%，58.46%，65.62%，76.46%，84.07%，抑制率与浓度变化呈正相关，IC50浓度为102 nM。

2.2　对H3122及H2228细胞株的放射增敏作用

采用50%的IC50值为实验药物浓度，选用160 nM及50 nM，作用时间为36 h，根据细胞克隆集落数目计算出细胞存活分数。在等量照射剂量下，附加药物照射的细胞存活分数低于单纯照射组。经计算两组的SER（D0）分别为1.064/1.079、SER（Dq）分别为1.004/1.047。

2.3　流式细胞术检测细胞凋亡及周期分布

H2228及H3122细胞的凋亡率与照射剂量呈正比。附加克唑替尼的细胞株经照射后细胞凋亡率明显高于单纯照射组。在H2228组细胞中，G0/G1期比率升高；S期比率减少；G2/M期比率升高。应用了克唑替尼后G0/G1期细胞阻滞现象尤为突出。在H3122组细胞中，作用前后各细胞周期比率均表现出相同的变化趋势。

2.4　Western Blotting检测克唑替尼对JAK-STAT3信号转导通路相关信号蛋白的影响

根据克隆形成实验及流式细胞仪得到的数据，选择8 Gy放射剂量发现JAK-STAT3信号转导通路中重要的底物STAT3表达上升，及其磷酸化产物p-STAT3表达下降，H2228细胞株在放射线及克唑替尼的作用下，对STAT3磷酸化的阻滞作用较H3122细胞株更为明显。

3　讨论

NSCLC患者中大约有3%～5%的患者ALK基因重排，约2～5%NSCLC患者体内形成EML4-ALK融合蓝氨酸集美，高表达的EML4-ALK融合基因往往预后较差，而且对放、化疗抗拒。Soda M等人首次从1例62岁的吸烟肺腺癌患者的肿瘤组织中扩增得到3926bp组成的DNA片段，翻译转录得到1059个氨基酸组成的融合蛋白EML4-ALK [3]。各亚型中多见的是变体1型（EML4 13；ALK 20）占33%及变体3型（EML4 6a/b；ALK 20）占29%。EML4-ALK融合基因与EGFR突变之间是相互独立可共存 [4]。克唑替尼是口服型三磷酸腺苷竞争性抑制剂，可抑制ALK和MET酪氨酸激酶，还能够抑制ROS1 [5]和RON激酶的活性是目前使用较为广泛的针对EML4-ALK融合基因的靶向治疗药物 [6]。经细胞平板克隆法检测后，克唑替尼对于两细胞株均具有放射增敏作用，而对于H2228细胞株的放射增敏比更大；应用了克唑替尼及放射线后H2228细胞的G0/G1期细胞阻滞更明显。STAT3是JAKSTAT途径中最重要的底物，在信号转录和转导过程中起到关键的作用，是一种双功能蛋白，存在于细胞质中并与酪氨酸磷酸化的信号通路相偶联 [7]。JAK-STAT3信号转导通路的异常与肿瘤的细胞凋亡、血管新生、侵袭转移、增殖分化、免疫逃跑等密切相关 [8]。在克唑替尼及放射线的作用下，两细胞株均有抑制STAT3磷酸化的作用，对于H2228细胞株的阻滞效果更明显。阻断了以STAT3为中心的JAK-STAT3信号转导通路，进一步抑制了肿瘤细胞的血管新生、侵袭转移、增殖分化、免疫逃跑的能力，最终促进了肿瘤细胞的凋亡，肿瘤组织的缩小。