大黄中游离蒽醌的提取、分离的实训操作※

王 英 万 红 彭志芬

（江西中医药高等专科学校药学系，抚州 344000）

大黄中游离蒽醌的提取、分离的实训操作※

王 英 万 红 彭志芬

（江西中医药高等专科学校药学系，抚州 344000）

大黄是我国的常用中药之一，含有多种蒽醌化合物，是具有代表性的蒽醌类衍生物，在中药化学、天然药物化学课程中都有大黄中游离蒽醌的提取、分离与检识的实验课程，在操作中运用到回流、连续回流、PH梯度法和色谱法。目的 通过对大黄中游离蒽醌的提取、分离的实训操作，使学生能够轻松掌握回流、连续回流、PH梯度法的原理及操作技术，鉴定方法和运用色谱法进行蒽醌类成分的鉴别。

大黄；游离蒽醌；中药化学

大黄是我国的四大中药之一，名火参、金木、破门、绵纹等，来源于蓼科植物掌叶大黄、药用大黄或唐特大黄的根及根茎。性寒，味苦，具有攻积导滞、泻火凉血、活血化瘀、利胆退黄的功效，内服治疗肠胃积滞、大便不通，外用治疗烧伤，并有止血作用，近来又将大黄中的游离蒽醌用作抗菌消炎药，其药性峻烈，素有“将军”之称，是具有代表性的蒽醌类衍生物，在中药化学、天然药物化学课程中都有大黄中游离蒽醌的提取分离与检识的实验，如何上好本实验课，我们认为如下做，有利于学生掌握操作。

1 讲解实验目的要求

掌握回流、连续回流、PH梯度法的原理及操作技术。掌握蒽醌类化合物鉴定方法。能够运用色谱法进行蒽醌类成分的鉴别。

2 讲解实验原理

大黄的主要成分为为蒽醌化合物，含量约为3%～5%，大部分与葡萄糖结合苷，游离苷元主要有大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酚，结构如图1：

大黄中的羟基蒽醌苷经酸水解成游离蒽醌苷元，苷元可溶于氯仿而被提取，再根据各羟基蒽醌的酸度差异，可用碱性强弱不同的溶液进行梯度萃取分离。其中，大黄酸具有羧基，酸性最强；大黄素具有β-酚羟基，酸性第二；芦荟大黄素连有羟甲基，酸性第三；大黄素甲醚和和大黄酚的酸性最弱。

3 实验所需仪器和试剂

电热套、圆底烧瓶、索氏提取器、滤纸、薄层板、喷瓶、20%硫酸、氯仿、浓盐酸、分液漏斗、柠檬酸-磷酸氢二钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、冰醋酸、石油醚、CMC-Na、苯、乙酸乙酯、甲醇 氨、KOH

4 讲解实验内容与指导操作

本实验讲解的要点：pH梯度萃取的原理及注意事项。设计萃取分离方案的程序与方法。

4.1 游离蒽醌的提取 酸水解：称取大黄粗粉50 g，置500 mL圆底烧瓶中加20%H2SO4水溶液100 mL，在水浴上加热回流4小时，放冷，抽滤，滤饼用水洗至近中性（pH约为6），于70℃干燥后，研碎，装入滤纸筒内，置索氏提取器中，加入氯仿200 mL回流提取3～4小时，得游离蒽醌的氯仿提取液。

注意事项：①大黄中的蒽醌类成分大部分与糖结合，以蒽醌的形式存在于植物组织中。所以要用酸水解使其生成苷元。蒽醌苷元可溶于氯仿、苯及乙醚等有机溶剂，用氯仿或苯时，注意有毒，应在通风橱中操作，严防中毒；②所得的氯仿液中如带有酸水液，应该用分液漏斗分出弃去，并用蒸馏水回洗一次除去酸性以免影响梯度萃取。氯仿提取液放置中如有沉淀析出，可滤取之，该沉淀多为大黄素，余液进行下一步分离试验用。4.2 PH梯度萃取分离

4.2.1 大黄酸的分离 将氯仿提取液加入250 mL分液漏斗中（使用前先检漏），一次性加入PH8缓冲溶液70 mL（约为氯仿溶液的1/3量)，振摇萃取，静置，充分分层后，分取缓冲溶液于烧杯中，保留氯仿溶液。缓冲液用浓盐酸酸化至PH 2～3左右，析出大黄酸沉淀。（注意：加酸时应缓慢加入，以防酸液溢出）。抽滤后，沉淀用蒸馏水洗至近中性，低温干燥，再用冰醋酸重结晶，得大黄酸黄色针晶，刮下颗粒并称重。

4.2.2 大黄素的分离 分离大黄酸的氯仿溶液，再一次性加入PH9.9缓冲溶液100 mL（约为氯仿溶液的1/2量)，振摇萃取，静置，充分分层后，分取缓冲溶液于烧杯中，保留氯仿溶液分取缓冲溶液于烧杯中，保留氯仿溶液。缓冲液用浓盐酸酸化至PH 2～3左右，析出大黄素沉淀。（酸化时注意操作同前）。静置，过滤，沉淀用蒸馏水洗至近中性，低温干燥，再用吡啶重结晶，得大黄色针晶，刮下颗粒并称重。

4.2.3 芦荟大黄素的分离 分离大黄素的氯仿溶液，再一次性加入5%Na2CO3-5%NaOH（9∶1） 碱性溶液200mL（约为氯仿溶液的1倍)，振摇萃取，静置充分分层，分取碱性溶液于烧杯中，保留氯仿溶液。碱液用浓盐酸酸化至PH2-3左右，析出芦荟大黄素（酸化时注意操作同前）。静置，过滤，沉淀用蒸馏水洗至近中性，低温干燥，用乙酸乙酯重结晶，得橙色针晶的芦荟大黄素纯品。

4.2.4 大黄酚和大黄素甲醚的分离 分离芦荟大黄素的氯仿溶液，再以2%NaOH水溶液振摇萃取至碱水层近无色为止（3～4次)，合并NaOH萃取液于烧杯中，用浓盐酸酸化至PH2-3左右，析出沉淀，静置。过滤，沉淀用蒸馏水洗至近中性，低温干燥，取干燥后的沉淀溶于小体积石油醚中，作为柱色谱的样品溶液。

装柱：色谱柱用铁架台固定后，将一小团脱脂棉放于柱底部使形成一个较松的垫层，关闭活塞，倒入少量洗脱剂。取纤维素粉8 g，加入已装有水饱和石油醚（60～90℃)，待纤维素粉完全沉降后，打开色谱柱下端的活塞，将色谱柱内液体放至与柱床平齐，关闭活塞。

样品上柱：将样品溶液用移液管小心加入到色谱柱柱床的顶端。

洗脱：用水饱和的石油醚（沸程60～90℃)洗脱，分段收集，约10 ml为一份，分别浓缩，经纸色谱检查，相同组分合并，分别得到大黄酚和大黄素甲醚。

4.3 样品鉴定

4.3.1 化学检识 分别取总蒽醌提取物少许，置烧杯中，用乙醚溶解，做如下反应。①碱液试验：取试液1 ml，加20%NaOH数滴，振摇放置分层后，观察颜色。溶液呈红色。②醋酸镁反应：取试样1ml，加醋酸镁试剂数滴，观察现象。溶液产生橙、红、紫等颜色。

4.3.2 薄层鉴定 吸附剂：CMC-Na薄层板。

样品：各蒽醌成分的1%氯仿溶液。

对照品：1%大黄酸标准品氯仿溶液、1%大黄素标准品氯仿溶液、1%芦荟大黄素标准品氯仿溶液。

展开剂：苯-乙酸乙酯 （8∶2） ;苯-甲醇 （8∶1）。

显色：（1） 氨熏后观察。（2） 5%KOH喷雾后观察。

5 讲解本实验注意事项

①大黄中的蒽醌类化学物的种类、含量与大黄的品种、采集季节、炮制方法及贮存时间均有关系，实验用药材应注意。②游离蒽醌的提取要控制温度，不宜太高，回流不宜太剧烈，溶液保持微沸，防止药渣炭化，加热时要不断搅拌。③pH梯度萃取分离时，以保证提取充分，可以用薄层色谱作监测。④注意碱液浓度及萃取时的静置时间对实验结果的影响。⑤萃取用PH8缓冲为柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液；PH9.9缓冲为碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液。缓冲液的配制和碱液的配制要准确，配制好的缓冲液要测PH值。严格注意检查。⑥用各缓冲液进行萃取时，采用一次性加入的方法，实验证明，如将缓冲液分次萃取分离效果不理想。⑦分离萃取时一定注意乳化层的分出，不要混入，并且每步最好用新鲜CHCl3，回洗碱水液。

6 讲解实验报告要求

①记录大黄总蒽醌的提取方法及总蒽醌的分离程序（包括溶剂用量）。②总蒽醌的显色鉴别结果。③记录大黄素、大黄酸、芦荟大黄素的精制方法及薄层色谱鉴别结果。

7 布置思考题

①简述大黄中5种游离羟基蒽醌化合物的酸性与结构的关系。②pH梯度萃取法的原理是什么？如何利用该方法分离大黄中的5种游离羟基蒽醌化合物？

到此，整个实验完成。通过以上的讲解与训练，我们认为学生能够及时地掌握和消化本章节的内容。参考文献

[1]吴剑峰，王宁.天然药物化学[M].北京：人民卫生出版社，2011：230.

[2]吴立军.天然药物化学实验指导[M].北京：人民卫生出版社，2011：210.

[3]徐选明，刘新.大黄中大黄素提取工艺的优化[J].中国中医药信息杂志，2004，11，5.

[4]朱庆玲，李瑞和.大黄中大黄素的提取工艺研究[J].时珍国医国药，2006，17，3.

Practical Operation on the Extraction and Separation of the free Anthraquinones in Rhubarb Root and Rhizome

WANGYing,WANHong,PENGZhifeng
(Department of Pharmacy,JiangxiCollegeof TraditionalChineseMedicine,JiangxiProvince,Fuzhou344000,China)

Rhubarb root and rhizome is one of the commonly used Chinese medicines in our country,which contains a variety of anthraquinone compounds,and is a representative anthraquinone derivative.In Chemistry of Chinese Materia Medica and Natural Medicine Chemistry,there are experiment courses on the extraction,separation and detection of the free anthraquinones in rhubarb root and rhizome.In the operation,reflux,continuous reflux,PH gradient method and chromatography were used.Through the practical operation on the extraction and separation of the free anthraquinones in rhubarb root and rhizome,students can easily master the principle and operation technology of reflux,continuous reflux,PH gradient method,and identification method and the identification of the constituents of the anthraquinone by using chromatography.

rhubarb root and rhizome;free anthraquinones;Chemistry of Chinese Materia Medica

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.22.079

1672-2779（2015）-22-0148-02

江西省教育厅教改课题（No：JXJG-12-28-7）

2015-08-26）