新型亲和双水相成相剂Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)的制备*

彭 帅，邓 刚，刘 耀，王怡梅

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)



新型亲和双水相成相剂Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)的制备*

彭 帅，邓 刚，刘 耀，王怡梅

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

以小分子表面活性剂Triton X-100为载体，采用环氧氯丙烷(ECH)活化法偶联亚氨基二乙酸(IDA)，通过配位反应螯合Cu(Ⅱ)，合成了一种新型亲和双水相成相剂Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)，并对其合成条件进行了优化.结果表明：最佳活化工艺为n(ECH)∶n(Triton X-100)=2∶1,n(BF3)∶n(Triton X-100)=1∶25，冰浴反应22 h，按n(NaOH)∶n(Triton X-100)=1∶1加入NaOH，环氧化反应3 h，环氧产物得率达到72.4%；最佳偶联工艺为pH 13条件下，加入等摩尔的IDA，55 ℃反应21 h，IDA的偶联率为76.3%；最佳螯合工艺为在0.05 mol/L醋酸钠溶液中，n(CuSO4)∶n(Triton X-100-IDA)=1∶1，室温反应6 h，Cu(Ⅱ)的螯合率可达80.5%.通过测定Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)与阳离子型疏水改性聚氧乙烯(HM-EO)所构成的双水相系统的相图,知两者可形成带亲和配基的稳定双水相系统.

Triton X-100；双水相系统；固定化金属亲和分配;Cu(Ⅱ)

固定化金属离子亲和色谱(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography，IMAC)1975年由Porath等[1]提出，是一种利用特异性亲和作用分离蛋白质的方法，具有条件温和、简单快捷等优势，但由于其分离处理量有限、回收利用困难等导致该方法使用成本相对较高[2-4].如果把这种亲和介质引入到双水相系统中，不仅可以进行批次可循环萃取，大幅度降低使用成本，而且可以显著提高双水相的分配效率.文献[5]利用GMA-co-EDMA为载体制备得到了GMA-co-EDMA-IDA-Cu(Ⅱ)，并将其尝试用于谷胱甘肽的分离.夏海锋等[6]通过在琼脂糖微球上偶联亚氨基二乙酸(IDA)并螯合Ni(Ⅱ)，得到了一种镍离子亲和层析介质，并成功用于纯化基因工程目标蛋白酶.其他已合成的可用于双水相系统的亲和成相剂包括dextran-IDA-Cu(Ⅱ)和PEG-IDA-Cu(Ⅱ)[7-8]，研究表明这类介质可显著提高双水相萃取系统的选择性分配系数.因此，研究与开发新型亲和作用主导双水相成相剂已成为该领域的研究热点.

聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)是一种非离子型小分子表面活性剂，在水溶液中对膜蛋白具有增溶作用，并且具有良好的生物相容性，因此被广泛用作双水相系统的成相剂[9-10].本实验选用Triton X-100为载体，以环氧氯丙烷(ECH)为活化剂，IDA为螯合剂，Cu(Ⅱ)为配体，合成了一种新型亲和双水相成相剂Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)，并通过对活化反应过程中活化剂(ECH)、催化剂(BF3)和反应物NaOH的浓度、偶联反应过程中IDA的浓度及各反应过程的时间等因素的考察，优化了制备工艺，旨在获得高效、稳定、高性能的亲和作用双水相成相剂.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

疏水改性聚氧乙烯(HM-EO)购自Akzo Nobel Surface Chemistry公司(瑞典)；Triton X-100(C34H62O11，纯度>98%，上海生工生物工程有限公司进口分装，Mr为647);环氧氯丙烷、三氟化硼乙醚溶液、亚氨基二乙酸均为国药集团化学试剂有限公司生产;五水硫酸铜(上海山浦化工有限公司).其他试剂均为市售分析纯.

UV-2550紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；LC218制备型液相色谱系统(美国Agilent公司)；6230 Accurate-Mass TOF LC/MS系统(美国Agilent公司)；KjelFlex K-360全自动凯氏定氮仪(瑞士Buchi公司)；877 Titrino Plus自动滴定仪(瑞士Metrohm公司).

1.2 Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)的制备

1.2.1 Triton X-100上羟基的活化

首先，在三氟化硼的催化下，环氧氯丙烷开环并与小分子表面活性剂Triton X-100的羟基反应生成氯代物；然后，在氢氧化钠的作用下氯代物脱去氯化氢，闭环形成环氧活化Triton X-100.反应过程如图1所示.

1.2.2 IDA的偶联

在0.5 mol/L NaOH溶液中，缓慢加入IDA和环氧活化Triton X-100，搅拌至完全溶解，55 ℃水浴反应21 h，冷却后将反应液pH调为中性，2倍体积的氯仿萃取，脱溶剂并干燥，得到Triton X-100-IDA.反应式如图2(a)所示.

1.2.3 金属离子Cu(Ⅱ)的螯合

在0.05 mol/L醋酸钠溶液中，缓慢地加入Triton X-100-IDA和CuSO4·5H2O，室温搅拌反应6 h，2倍体积的氯仿萃取，脱溶剂并干燥，得到Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)，其化学结构见图2(b).

1.3 环氧产物含量的测定

环氧产物含量采用四乙基溴化铵-高氯酸非水滴定法[11]测定.准确称取0.5 g试样溶于5 mL氯仿中，加入4 mL冰醋酸，准确加入2 mL四乙基溴化铵和3滴结晶紫指示剂，混合均匀，用高氯酸标准溶液滴定，直至溶液颜色由蓝绿色变为绿色.

上式中：V为滴定所消耗高氯酸标准溶液的体积，mL；V0为空白滴定所消耗高氯酸标准溶液的体积，mL；C为高氯酸标准溶液的浓度，mol/L；M为Triton X-100的相对分子质量；W为所称取试样的质量，g；w为样品中Triton X-100的质量分数.

1.4 IDA偶联量的测定

凯氏定氮法，通过测定产物的含氮量换算出产物中IDA的含量.

1.5 Cu(Ⅱ)螯合量的测定

准确称取一定量的Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)，用0.05 mol/L EDTA溶液(pH=8.0)分解螯合的Cu(Ⅱ)，定容，以EDTA溶液为空白，在740 nm处测定吸收值，通过标准曲线得到Cu(Ⅱ)的含量[12].

1.6 LC/MS分子量测定

质谱条件：电喷雾离子源，采用正离子化模式；扫描质量范围m/z为50～1 000；干燥气(N2)流速为8 L/min，温度为350 ℃；毛细管电压为4 000 V.

1.7 Triton X-100-IDA的制备型色谱纯化

合成的产物Triton X-100-IDA加入流动相溶解，经0.22 μm微孔滤膜过滤并定容，最终样品溶液中含粗产物30 mg/mL.采用制备型液相色谱进行分离纯化，色谱条件：Agilent Prep-C18色谱柱(21.2 mm×250 mm，10 μm，10 nm)；流动相V(甲醇)∶V(水)=90∶10，流速为10 mL/min；检测波长为273 nm；进样量为5 mL[13].

1.8 双水相系统的配制及相图的测定

双水相胶束系统的配制：取一定量的Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)和HM-EO母液于10 mL玻璃离心管中，加入缓冲液，准确定量至5 g，振荡，充分混匀，25 ℃静置72 h，充分分相.

HM-EO含量的测定：准确称取一定量的待测样品，加入等质量的丙酮，以m(丙酮)∶m(水)为1∶1进行稀释，取稀释液0.5 g加入5 mL考马斯亮蓝G250显色液，放置30 min，在620 nm处测定吸收值，通过计算获得HM-EO的含量.

相图的绘制：配制的双水相胶束系统中HM-EO的质量分数均为2.5%，Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)的质量分数分别为0,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%和1.0%.取一定量的上相测定HM-EO的含量，并利用重量法(真空干燥法)得到上相中水的含量，通过计算得到上相中Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)的含量.同法可测得下相中各组分的含量.

2 结果与讨论

2.1 羟基活化反应条件的确定

2.1.1 活化剂浓度对环氧产物得率的影响

考察了交联活化剂(ECH)的浓度对环氧产物得率的影响，结果如图3所示.根据文献[14]选取3组不同的初始反应物配比，随着反应时间的延长，环氧产物得率都呈现出先升高、后降低、最后趋于平稳的趋势，且在反应3 h左右活化反应基本完成，尤其是当ECH与Triton X-100的摩尔比为2∶1时，环氧产物得率达到最高为72.4%.ECH浓度对环氧产物得率的影响较为明显，随着ECH浓度的增大，环氧产物得率反而减小，这与文献[15]报道的在含水体系中环氧产物得率随着ECH含量增大而增大并趋于稳定的结果不同.这可能是由于本实验在无水体系中进行，随着ECH浓度的增大，其强疏水性不利于NaOH扩散于反应溶液中[16]，进而导致活化反应的第2步相对较难进行，因此环氧产物的得率较低.

2.1.2 催化剂浓度对环氧产物得率的影响

三氟化硼是一种很强的Lewis酸，能够催化环氧键开环.在ECH与Triton X-100的摩尔比为2∶1时，考察了催化剂BF3的浓度对环氧产物得率的影响，结果见图4.在不同的BF3配比下，环氧产物得率随着时间的变化趋势大致相同：随着反应的进行，环氧产物得率先升高后降低，最后逐渐趋于平稳，并且都在反应3 h左右达到最大值；随着BF3浓度的增大，初始反应速度有所增加，并且在反应1～2 h内环氧产物得率迅速升高；当BF3与Triton X-100的摩尔比为1∶35时环氧产物得率明显较低，而其摩尔比为1∶15时环氧产物的得率低于为1∶25时，原因可能是随着反应时间的延长，BF3容易水解生成酸，使部分连接在Triton X-100上的环氧基在酸性环境发生酸化开环反应，导致环氧产物含量降低.因此，实验选取BF3与Triton X-100的摩尔比为1∶25进行下一步的反应.

2.1.3 NaOH浓度对环氧产物得率的影响

NaOH能够促使活化反应第1步得到的氯代产物脱去氯化氢形成环氧化产物，在n(ECH)∶n(Triton X-100)=2∶1,n(BF3)∶n(Triton X-100)=1∶25时，图5给出了不同NaOH用量对环氧产物得率的影响:在不同的NaOH浓度下，环氧产物得率都随着时间的延长快速升高，在反应3 h时环氧基取代度达到最高值，之后呈现降低趋势并逐渐趋于平稳；当NaOH浓度增大时，环氧产物的得率反而减小，这可能是由于NaOH浓度的增大在促进环氧产物形成的同时也使环氧基的水解作用加剧，因此，当NaOH与Triton X-100的摩尔比为1.6∶1时，环氧基的水解反应造成环氧产物得率降低.Matsumoto等[17]研究发现，在较低浓度的碱液反应体系中环氧基的水解可被有效抑制，使环氧产物含量在4 h左右维持恒定.本实验中加入NaOH之后环氧化反应3 h基本完成，因此整个反应对环氧产物的形成是有利的.

2.2 偶联IDA反应条件的确定

IDA是一种良好的鳌合剂，金属离子一般与IDA以3个配位键结合，空出的配位点可以与带有组氨酸标签的基因工程蛋白发生特异性亲和作用.环氧活化的Triton X-100与螯合剂IDA反应，可以制得Triton X-100-IDA.图6显示了IDA用量对偶联率的影响：在IDA和Triton X-100的摩尔比分别为1∶1和2∶1时，偶联率随着反应时间的延长快速升高，在21 h左右达到最高值76.3%，其后随着反应的进行偶联率降低；随着IDA浓度的增大，偶联率有所提高，但是最大值几乎相同.因此，实验选择IDA与Triton X-100的摩尔比为1∶1.

同时，实验中发现反应液的pH对IDA的偶联有较大的影响，随着pH值的升高，IDA的偶联率快速增加，当pH值为13时达到最高(见图7).这与文献[17]在凝胶上偶联IDA的结果相符.

2.3 Triton X-100-IDA的纯化

研究表明，Cu(Ⅱ)的螯合量随着IDA偶联率的升高而增大[18-19].这就意味着：IDA偶联产物的纯度越高，其与Cu(Ⅱ)的螯合量也相应增加.为了提高Triton X-100-IDA与Cu(Ⅱ)的螯合率，获得较优的终产物，因此采用制备型高效液相色谱对Triton X-100-IDA进行了纯化，结果如图8所示，明显有2个峰(峰1和峰2)，分别收集，脱溶剂并干燥得到样品，峰1为油状物，峰2为膏状物.质谱分析结果显示，峰2的ESI-MSm/z：[M+H]为791.4，[M+Na]为813.5，分子量与Triton X-100-IDA一致.因此，峰2所得产物为合成的Triton X-100-IDA.

2.4 Cu(Ⅱ)的螯合

在以上所得最佳活化和偶联条件下制备得到Triton X-100-IDA，然后以CuSO4与Triton X-100-IDA的摩尔比为1∶1在醋酸钠溶液中室温搅拌反应6 h，得到Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)，Cu(Ⅱ)的螯合率可达80.5%.

2.5 HM-EO/Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)双水相系统的相图

测定了双水相系统中HM-EO的含量均为2.5%，Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)的质量分数分别为0,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%和1.0%，在pH 7，25 ℃下的相图(见图9).结果表明，带有亲和配基的小分子表面活性剂Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)与HM-EO能形成稳定的双水相系统.图9中：内部直线为双节线，曲线为双节点曲线，曲线内部代表的是双相区，外部为单相区，并且两相中含水量均超过90%，表明该系统适合用于生物活性分子的分离.

3 结 论

本研究以小分子表面活性剂Triton X-100为载体、环氧氯丙烷(ECH)为活化剂、亚氨基二乙酸(IDA)为螯合剂、Cu(Ⅱ)为配体合成得到了Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)，并对羟基活化、IDA偶联和Cu(Ⅱ)螯合等过程中的工艺参数进行了优化，获得了最佳的制备路线.实验结果如下：

1)活化反应：n(ECH)∶n(Triton X-100)=2∶1,n(BF3)∶n(Triton X-100)=1∶25，冰浴反应21 h，然后加入400 g/L氢氧化钠，n(NaOH)∶n(Triton X-100)=1∶1，环氧化反应3 h，环氧产物得率达到72.4%.

2)偶联反应：pH 13，n(IDA)∶n(Triton X-100)=1∶1，55 ℃反应21 h，IDA的偶联率为76.3%.采用LC/MS测定了偶联反应产物的分子量，与Triton X-100-IDA的分子量相符.

3)螯合反应：经制备型液相色谱纯化后的偶联产物在n(CuSO4)∶n(Triton X-100-IDA)=1∶1，0.05 mol/L的醋酸钠溶液中，室温反应6 h，Cu(Ⅱ)的螯合率可达80.5%.

4)双水相系统相图的考察结果表明，Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)与HM-EO能形成稳定的双水相系统.

本实验合成得到的Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)是一种新型亲和双水相成相剂，在后续的研究中将与其他成相聚合物构成亲和作用主导的双水相胶束系统，可用于循环萃取、回收高附加值的重组蛋白，有一定的规模化、商业化应用前景.

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(责任编辑 薛 荣)

Preparationofanovelphase-formingcomponentTritonX-100-IDA-Cu(Ⅱ)foraffinityaqueoustwo-phasesystem

PENG Shuai，DENG Gang，LIU Yao，WANG Yimei

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,JinhuaZhejiang321004,China)

A novel phase-forming component for affinity aqueous two-phase system, Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ) was prepared. The nonionic surfactant (Triton X-100) was used as the matrix, which was activated by epichlorohydrin (ECH) and coupled with iminodiacetic acid (IDA), and finally chelated with Cu(Ⅱ). The synthesis conditions on Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ) was optimized systematacially. The result indicated that the yield of Triton X-100-epoxide above 72.4% was achieved in the ice-water bath consisting ofn(ECH)∶n(Triton X-100) = 2∶1,n(BF3)∶n(Triton X-100) = 1∶25 for 22 hours and then as the molar ratio of NaOH to Triton X-100 was 1∶1 for 3 hours. After reacting under the optimal linkaging conditions asn(IDA)∶n(Triton X-100) = 1∶1, pH 13, 55 ℃, 21 hours, the maximum yield of Triton X-100-IDA was 76.3%. In the solution composed ofn(CuSO4)∶n(Triton X-100-IDA) = 1∶1 at room temperature for 6 hours, the chelating yield of Cu(Ⅱ) reached 80.5%. Phase diagram determination showed that Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ) and HM-EO could compose stable affinity aqueous two-phase system (ATPS).

Triton X-100; aqueous two-phase system; immobilized metal ion affinity partitioning; Cu(Ⅱ)

10.16218/j.issn.1001-5051.2015.04.011

2015-01-20；

：2015-03-08

国家自然科学基金资助项目(21006098)

彭 帅(1988-)，男，河南项城人，硕士研究生.研究方向：生物化工.

邓 刚.E-mail: denggang@zjnu.cn

O658

：A

：1001-5051(2015)04-0420-06