四川泡菜盐卤中微生物总基因组DNA提取方法的比较

蒋云露，杨建涛，王猛，罗军，蒋倩，姜露熙，张琴，饶瑜，马力*

（西华大学生物工程学院，四川成都610039）

四川泡菜盐卤中微生物总基因组DNA提取方法的比较

蒋云露，杨建涛，王猛，罗军，蒋倩，姜露熙，张琴，饶瑜，马力*

（西华大学生物工程学院，四川成都610039）

了得到较高质量的基因组脱氧核糖核酸（DNA），本实验采取了5种方法对四川泡菜盐卤总基因组进行提取，对其提取的浓度、纯度进行分析比较，并以此为模版进行聚合酶链反应（PCR）体外扩增。结果表明，F1所得的基因组DNA纯度及浓度最高，F4方法提取的基因组DNA浓度较高，但受到蛋白或酚类物质的污染，F2以及F5两种方法得到的基因组DNA浓度较低，F3所得的基因组DNA浓度低并且含有较多RNA杂质。因此，本研究采用的5种对四川泡菜盐卤进行总基因组提取方法中，方法F1最合理、高效。

四川泡菜；基因组；提取；比较

四川泡菜是一类以新鲜蔬菜为原料，在一定浓度的盐溶液中，经乳酸菌发酵而成的一种传统食品。以乳酸菌为主的微生物在发酵过程中产生风味物质，赋予四川泡菜色、香、味及健康因子[1-2]。研究发酵过程中的微生物种类和动态变化有助于了解四川泡菜的发酵及其风味形成规律。利用传统的实验室微生物分离培养方法，由于环境的复杂性和培养条件的限制，能用现有技术培养的微生物仅占微生物总数的1%左右[3]，不能准确及时的反映出某一生态环境中微生物的构成和变化规律。目前，以某一生态环境中的总基因组为模板，扩增大分子16S/18S rDNA作为一个分子指标，广泛地应用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究[4]。

目前，提取总基因组的方法很多。研究者尝试过多种多样的提取总脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的方法，根据微生物细胞壁裂解方法的不同，主要可分为三大类：（1）物理方法如研磨、高温、超声波等。（2）化学方法如高盐浓度十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate， SDS）法等。（3）酶裂解法如蛋白酶K、溶菌酶等[5]。根据实验目的不一样，这几种方法各有各的优缺点。通过物理方法得到的基因组DNA片段往往较小，约5～10 kbp，并且产率较低[6]，不适合普遍应用。化学方法和酶裂解法，目前应用得比较多，但是仍然存在缺点，即是较难获得大片段DNA，一般小于700 kbp[7]。此外还有各种有针对性的试剂盒用于不同样品总基因组的提取。

之前有研究报道，称土壤中存在的腐殖酸等抑制因素可以干扰裂解、降解微生物DNA使后续反应酶失活，使其DNA的提取具有一定难度[8-10]。四川泡菜中具有较复杂的生态环境，盐浓度和植物腐殖质都会对其中微生物基因组的提取和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增造成影响。本研究采用快速提取法以及4种不同DNA提取试剂盒进行实验对比，分别提取四川泡菜盐卤中的微生物总基因组，比较其产物的浓度及纯度。然后进行16S rDNA PCR体外扩增，对比不同方法提取的DNA进行PCR体外扩增的成功率。从而分析得出提取泡菜盐卤总基因组质量最好的方法。为四川泡菜发酵及腐败过程中微生物区系的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青菜：购于成都某菜市场；将新鲜青菜洗净晾干后，取800 g放入加有1 500 mL盐质量浓度为6 g/100 mL盐卤的泡菜坛中，在坛沿加水密封。静置发酵3个月。

提取缓冲液（extraction buffer）、酚-氯仿-异戊醇体积比（25∶24∶1）、无水乙醇、体积分数为70%乙醇：成都科龙试剂厂；酸洗玻璃珠、100 μg/mL核糖核酸酶A（RNase A）：美国Sigma公司；土壤DNA提取试剂盒、水样DNA提取试剂盒：成都福际生物公司；土壤DNA提取试剂盒、水样DNA提取试剂盒：美国OMEGA公司。

1.2 仪器与设备

MULTIFUGE X1R台式冷冻离心机：美国BECKMAN公司；Eppendorf AG22331 PCR仪、T2A凝胶成像系统：美国伯乐BIO-RAD公司；DYY-8C电泳仪：北京六一仪器厂；SYQ-DSX-280B立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；UV-2600分光光度计：德国EPPENDORF公司。

1.3 实验方法

1.3.1 取样

用移液管移取40mL盐卤于50mL离心管中，6000r/min离心15 min，去除上清液，重复3次。沉淀用1.5 mL无菌蒸馏水冲洗管壁，将液体转移至2 mL离心管中，8 000 r/min离心1 min，弃上清，向2 mL离心管中加入1.5 mL无菌蒸馏水，漩涡振荡使沉淀重悬，8 000 r/min离心1 min，弃上清。重复3次以去除杂质，得到干净的菌体沉淀。

1.3.2 总基因组DNA的提取

快速提取法提取总基因组DNA：将1.3.1中得到的沉淀重悬于200 μL提取缓冲液（extraction buffer）中，同时加入200 μL酚-氯仿-异戊醇（体积比25∶24∶1）、0.3 g酸洗玻璃珠，漩涡振荡3 min，10 000 r/min条件下离心5 min，取上清重复3次。向离心管中加入所取上清体积2倍的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃、30 min沉淀核酸。10 000 r/min条件下离心5 min，弃上清。向离心管中加入1 mL体积分数为70%乙醇，上下颠倒数次，10 000 r/min条件下离心2 min，去上清，沉淀置于37℃、20 min烘干，然后重悬于50 μL 100 μg/mL RNase A中，37℃水浴30 min后置于-20℃备用。

4种不同DNA提取试剂盒提取总基因组的DNA方法：参考各DNA提取试剂盒说明书进行。

1.3.3 检测基因组DNA的纯度与浓度

各种方法提取得到的总基因组的DNA，各取5 μL于1.0%琼脂糖凝胶，100 V电泳40 min，凝胶成像仪下观察其条带直观检测其DNA浓度。此外，通过紫外分光光度计分别测定这五种方法提取的基因组DNA在260 nm，280 nm处的吸光度值OD260nm、OD280nm。并根据OD260nm/OD280nm计算其基因组DNA纯度[11-12]。纯DNA的OD260nm/OD280nm值为1.80，大于或小于这个值的样品DNA都分别受到RNA或蛋白质、酚类物质的污染。OD260nm=50 ng/μg计算基因组DNA原液的浓度，因此基因组DNA浓度计算公式如下：

式中：[dsDNA]是所提基因组DNA浓度，ng/μL；OD260nm是DNA在波长260 nm处的吸光度值。

1.3.4 16S rDNA PCR体外扩增

为了进一步检测细菌基因组DNA的质量，将所提取总基因组作为模版，以Eu27F和1490R引物。扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min，进行16S rDNA片段的体外扩增。将扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检验。有关引物序列见表1所示。

2 结果与分析

2.1 凝胶电泳检测检测基因组DNA

利用琼脂糖凝胶电泳检测各种方法提取的基因组DNA样品，结果如图1所示。

由图1可知，F1、F2基因组条带清晰明亮，无拖尾现象。F3基因组条带模糊，有一定拖尾现象，说明所提取的基因组中可能出现降解现象或者是混有较多的核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）[14]。F4、F5基因组条带清晰，但是亮度较弱，说明所提取的基因组浓度较低。

2.2 基因组DNA的纯度与浓度

基因组纯度和浓度的测定结果如表2所示。由表2可知，F1的基因组DNA的质量浓度最高为30.0 ng/μL，F4次之为27.0ng/μL，F3的基因组DNA质量浓度最低为13.6ng/μL。从图2中OD260nm/OD280nm的比值分析基因组DNA纯度结果可知，F1的基因组DNA纯度最高，而F3和F4的基因组DNA纯度相对较低。F3的OD260nm/OD280nm值为1.91，较纯DNA的OD260nm/OD280nm值1.80高出0.11，说明该基因组DNA中混有RNA杂质。F4的OD260nm/OD280nm值为1.71，较纯DNA的OD260nm/ OD280nm值1.80偏低，说明该基因组DNA受到蛋白或酚类物质的污染。

2.3 PCR扩增检测各基因组的质量

以5种方法提取的基因组为模版，进行16S rDNA PCR扩增，扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。

由图2可知，利用快速提取法提取基因组为模版进行16S rDNA PCR扩增，1泳道无条带，因此扩增失败，而2、3、4、5泳道均成功。说明F3基因组浓度过低，且含较多杂质。F1与F2基因组PCR条带清晰明亮，说明F1与F2基因组浓度较高且含杂质较少，F4及F5基因组PCR条带清晰，但亮度较弱，说明F2及F5基因组浓度较低或者纯度不高，含有杂质。

3 结论

DNA提取是裂解细胞膜、细胞核后提取核酸、去除蛋白质、脂类和多糖等物质的过程，作为一种常规技术在分子生物学研究中发挥着举足轻重的作用[15]。

四川泡菜盐卤组成较为复杂，含有各种离子、腐殖质、有机酸、无机盐等，因此对其进行基因组提取较为困难，以提取得到基因组作为模版进行后续操作的结果也不太理想。因此本研究对5种不同方法提取四川泡菜盐卤基因组DNA结果进行分析比较，得出F1方法提取得到的基因组DNA浓度和纯度均最高，并且在后续PCR扩增检测中条带清晰。F4方法提取的基因组DNA浓度较高，但受到蛋白或酚类物质的污染，需对所得基因组DNA进一步纯化。F2和F5两种方法得到的基因组DNA浓度较低，且纯度也不高。F3所得的基因组DNA浓度低并且含有较多RNA杂质。因此，用成都福际生物公司的土壤DNA提取试剂盒来提取四川泡菜盐卤总基因组相对而言较为合理，可为后续实验提供质量较高的基因组DNA。

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JIANG Yunlu,YANG Jiantao,WANG Meng,LUO Jun,JIANG Qian,JIANG Luxi,ZHANG Qin,RAO Yu,MA Li*
(School of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China)

In order to get high quality genomic DNA,the total genomic was extracted from Sichuan pickled vegetables broth by five methods,and the purity and concentration of DNA products were compared and analyzed.The genomic DNA was then used as templates for PCR amplification.The results showed that the quality of DNA extracted by method F1 had the highest concentration and purity,the genomic DNA extracted by F4 was with high concentration but contaminated with protein or phenols.The genomic DNA extracted by F2,F5 and F3 had low concentration,and the genomic DNA extracted by F3 had RNA impurity.In conclusion,method F1 was the optimal method for genomic DNA extraction from Sichuan pickled vegetable samples.

Sichuan pickled vegetables;genomic;extraction;comparison

TS255.1

A

0254-5071（2015）04-0090-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.020

2015-03-17

国家级大学生创新创业训练计划项目（201410623008）；西华大学重点实验室开放项目（szjj2013-047）

蒋云露（1991-），女，硕士研究生，研究方向为食品安全。

*通讯作者：马力（1956-），男，教授，本科，研究方向为食品微生物。