HPLC法检测分析温度对中药口服液品质的影响

李沙，郭栋，王晓雯，朱万军，罗立新*

（1.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006；2.无限极（中国）有限公司，广东江门529156）

HPLC法检测分析温度对中药口服液品质的影响

李沙1，郭栋2，王晓雯1，朱万军2，罗立新1*

（1.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006；2.无限极（中国）有限公司，广东江门529156）

运用高效液相色谱法（HPLC）比较分析了正常、异常中药（TCM）口服液中美拉德反应产物组成及其对中药口服液质量的影响。结果表明，异常样品的还原糖、蛋白质含量、美拉德反应中间产物糠氨酸、糠醛、5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺以及氨基酸含量如赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸等均比正常样品偏高。采用不同温度处理提取的类黑素的黑化程度随加热温度的升高而增强。美拉德反应程度随样品烘干温度的升高而增加，高温处理不利于中药口服液样品的安全性。

中药；高效液相色谱；美拉德反应产物；类黑素；5-羟甲基糠醛

中药（traditional Chinese medicine，TCM）口服液是在中药汤剂基础上发展起来的，既保持了原有汤剂的固有特色又具有发挥疗效较快、携带方便、作用明显、保存性能良好等优点，因此近年来深受广大生产商的青睐，使得中药口服液的品种发展较多也较快。

美拉德反应（Maillard reaction）按其本质而言是指羰基化合物和氨基化合物之间发生的缩合反应。在中药及食品中反应物通常是还原糖、氨基酸、蛋白质和肽类，是食品以及中药口服液中香味产生的主要来源之一[1]。几乎所有含有羰基和氨基的食品及中药材料在加热条件下均能产生Maillard反应[2]。Maillard反应产物与反应温度、时间、pH值、溶剂等有重要关系，也与参与反应的氨基酸、蛋白质、糖等有很大关系。在Maillard反应过程中有很多重要的产物形成，并能赋予中药口服液独特的风味和色泽[3]。所以，对于中药口服液的Maillard反应产物的研究已成为必然趋势。而运用高效液相色谱的方法检测Maillard反应的主要中间产物是现在较为高效准确的方法之一[4]。

5-羟甲基糠醛是葡萄糖或果糖等单糖化合物在高温或酸性条件下，催化脱水产生的一种醛类化合物，是美拉德反应的重要中间产物[3，5-6]；糠氨酸是美拉德反应生产的特定产物，近年来，糠氨酸常被用作判断食品受热程度的指标，在蛋类、谷物、乳制品、肉制品、中药口服液中均有应用[7]。糠醛是美拉德反应中还原糖和氨基酸或蛋白质中的自由氨基缩合生成的席夫碱经过一系列的反应而产生的美拉德中间产物[3]。类黑素是指Maillard反应后期形成的呈棕褐色的物质，它是一类聚合度不等、结构复杂的高分子聚合物混合体[8-9]。丙烯酰胺是一种具有神经毒性的潜在致癌物质，长期食入过量的丙烯酰胺可损害遗传物质并导致基因损伤，最后诱发癌变，现已被国际癌症研究中心（international agency for research on cancer，IRAC）列为ⅡA类致癌物[10-11]。它在美拉德反应中主要是由天门冬酰胺与还原性糖反应产生。在中药口服液的制作过程中往往因为加热温度过高而使得成品中出现黑色小颗粒状沉淀，发生这种情况主要是由于高温加热富含蛋白质、氨基酸及还原糖的中药原材料产生的美拉德反应产物发生了一系列复杂反应所造成的。本研究主要是利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测分析两种不同温度烘干的中药口服液样品中的主要美拉德反应中间产物：游离氨基酸、糠氨酸、糠醛、5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF），并且对食品及药品较关注的具有神经毒性的潜在致癌物质丙烯酰胺进行含量测定；利用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法测定还原糖含量以及使用福林-酚（Folin-Ciocalteu）法测定蛋白质含量，并且对中药样品中的Maillard反应终产物类黑素进行提取并用不同温度、不同时间来处理类黑素，同时观察其外观品质变化情况。目的是控制中药口服液制作过程中温度及检测Maillard反应产物，对中药口服液的品质保证和食用安全性具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

正常和异常中药口服液样品：广东某医药公司。

糠氨酸标准品：法国NeoMPS公司；羟甲基糠醛标准品、糠醛标准品、丙烯酰胺标准品：上海生化试剂公司；18种氨基酸混合标准液（货号：AAS18-5ML）、牛血清蛋白：美国Sigma公司；四氢呋喃（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、三乙胺（化学纯）：天津科密欧有限公司；异硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）：阿拉丁公司；葡萄糖、三水醋酸钠：天津市大茂化学试剂厂；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Waters-2695高效液相色谱仪、UV2489紫外检测器：美国Waters公司；AgilentC18色谱柱：美国安捷伦公司；3K30型高速冷冻离心机：德国SIGMA公司；CARY50紫外-可见分光光度计：上海魁元科学仪器有限公司；ALPHA1-4真空冷冻干燥机：德国CHRiST公司；Thermo Forma 902超低温冰箱：美国Thermo Forma公司；HK-35AS恒温干燥箱：武汉科创机械设备责任有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准品及样品的制备

（1）分别取同一批次生产的3瓶正常样品编号：正1、正2、正3。取同一批次生产的3瓶异常样品编号：异1、异2、异3。每一瓶样品分析均做3个平行。正常样品的烘干条件为118～120℃高温高压蒸汽杀菌30 min，40～50℃烘干14 h。异常样品的烘干条件为118～120℃高温高压蒸汽杀菌30 min，90～100℃烘干1 h。正常样品底部只出现褐色沉淀，而异常样品底部还出现了黑色小颗粒状沉淀，且外观色泽更深。

（2）将样品10 000 r/min离心5 min取100 μL上清液于干燥管中加入20 μL的0.02 mol/mL正亮氨酸作为内标物，真空冷冻干燥。将20 μL的氨基酸标准品（标准品中的氨基酸均以2.5 μmol/mL浓度溶于0.1 mol/mL HCl溶液，但L-胱氨酸浓度为1.25 μmol/mL）置于干燥管中并分别加入20 μL的0.02 mol/mL正亮氨酸作为内标物，真空冷冻干燥。

（3）向干燥管中加入干燥剂（乙醇∶水∶三乙胺=2∶2∶1，V/V）的溶液200 μL，真空冷冻干燥，重复上述操作一次。

（4）加入200 μL衍生剂（乙醇∶三乙胺∶水∶PITC=7∶1∶1∶1，V/V），室温放置20 min使PITC与样品中的氨基酸充分反应生成胺甲酰基氨基酸（PITC-AA）。

（5）真空冷冻干燥后于-20℃冰箱放置储存，样品进样前用0.1 mol/mL的HCl溶解并用初始流动相（即95%A+ 5%B）稀释进样。

1.3.2 还原糖及蛋白质含量的测定

还原糖按照国标GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》中的3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定[12]。蛋白质按照福林-酚（Folin-Ciocalteu）法测定[13]。

1.3.3 类黑素的提取及处理

采用有机溶剂沉淀法提取类黑素[14]：先取10 mL样品加17.5 mL无水乙醇离心收集沉淀，再往上清中加入等体积丙酮并离心收集沉淀，然后把两次得到的沉淀加水溶解，最后重复用无水乙醇和丙酮沉淀得到类黑素。分别将正常及异常样品的类黑素分成6份，其中3份正常样品和3份异常样品分别置于6个培养皿中，另外6份样品分别加1 mL超纯水混匀置于50 mL离心管中。分别将置于培养皿及离心管中正常及异常样品于100℃的烘箱处理1 h、70℃烘箱处理2 h、50℃烘箱处理14 h。

1.3.4 HPLC检测样品中的游离氨基酸、5-羟甲基糠醛、糠

氨酸、丙烯酰胺及糠醛的含量

PITC柱前衍生法结合内标法用高效液相色谱方法测样品中的游离氨基酸[15]。

色谱条件：色谱柱AgilentC18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；检测器：UV2489紫外检测器；检测波长254 nm；流动相A相20 mmol/L三水醋酸钠（pH=7.2±0.05）+0.5%四氢呋喃；B相20 mmol/L三水醋酸钠（pH=7.2±0.05）∶甲醇∶乙腈=1∶2∶2；流速1 mL/min；进样量10 μL；温度38℃。梯度洗脱程序见表1。

外标法同时测定样品中的5-羟甲基糠醛（5-HMF）、糠氨酸、丙烯酰胺[16]。

色谱条件：色谱柱Agilent C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；检测器：UV2489紫外检测器；检测波长：280 nm；流动相为：0.1%乙酸-100%乙腈=85∶15（V/V）；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；温度：30℃；等度洗脱。

标准品和样品的制备及处理：称量需要的标准品，然后样品与标准品均用流动相稀释（100 μL的标准品/样品+ 900μL流动相），标准品直接用0.22 μm的滤膜过滤待测，样品8 000 r/min离心2 min，取上清，然后用0.22 μm的滤膜过滤待测。

外标法测定样品中的糠醛的含量[17]。

色谱条件：色谱柱Agilent C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；检测器：UV2489紫外检测器；检测波长275 nm；流动相100%甲醇∶水=70∶30（V/V）；流速1 mL/min；进样量：10 μL；温度30℃；等度洗脱。

标准品和样品的制备及处理：称量需要的标准品，然后样品与标准品均用流动相稀释（100 μL的标准品/样品+ 900μL流动相），标准品直接用0.22 μm的滤膜过滤待测，样品8 000 r/min离心2 min，取上清，然后用0.22 μm的滤膜过滤待测。

2 结果和分析

2.1 还原糖、蛋白质含量测定结果

葡萄糖、牛血清蛋白标准曲线如图1所示。由图1可知，在所测质量浓度范围内，葡萄糖质量浓度和牛血清蛋白质量浓度与吸光度值均呈正比。葡萄糖标准曲线的回归方程为y=2.047x+0.155 9，相关系数R2为0.996 7；牛血清蛋白标准曲线回归方程为y=1.043 9x+0.008 1，相关系数R2为0.997 3，表明在测定范围内显色灵敏、稳定且成良好线性。

样品中的还原糖、蛋白质含量测定结果如图2所示。由图2A可知，异常样品的还原糖含量明显比正常样品的高，正常样品还原糖含量在6.5 g/100 mL左右，而异常样品的还原糖含量＞6.7 g/100 mL。由图2B可知，异常样品的蛋白质含量也比正常样品的略高（异2除外）都接近3 g/100 mL，与富含蛋白质的牛奶样品中蛋白质含量基本一致[18]。如果蛋白质含量较高，样品在进行加热处理后很有可能导致游离氨基酸含量较高。从实验结果可知高温短时间处理会使得中药样品的原材料更好的分解成还原糖和蛋白质，从而使得异常样品中的还原糖和蛋白质含量相对正常样品略高。样品中较高的还原糖和较高的蛋白质或者游离氨基酸在适宜的条件下就极易发生美拉德反应，从而产生美拉德反应中间产物及最终产物。

2.2 类黑素的提取及在不同温度和时间条件下处理结果

正常样品和异常样品提取的类黑素在未经过高温处理的情况下以及两种样品置于平板中和试管中的类黑素经过不同温度、不同时间烘干处理后的外观颜色变化如图3所示。由图3可知，类黑素在100℃处理1 h严重变黑，而在70℃处理2 h也会变黑，但变黑程度却没有100℃明显。但是，类黑素在50℃条件下处理14 h后依然未明显变黑。并且，对比A、B和E、F中的1明显可以看出100℃处理1 h平板中的褐色类黑素固体变为黑色颗粒固体物质，对比C、D中的1和3可知，100℃处理1 h的试管中的类黑素虽然发黑但由于其悬浮在液体中，只能看出样品由原本的棕褐色液体变成黑色液体。结果表明，类黑素会因为处理温度过高而发生黑化反应，且无论是培养皿中的类黑素还是含水的试管中的类黑素都是随着处理温度的升高，其变黑的程度加剧。因此，高温条件下剧烈的美拉德反应后产生的大量类黑素在高温处理条件发生了黑化反应不仅会使中药口服液的液体呈现出黑色而且严重时会出现黑色颗粒状物质。所以，对于可发生剧烈美拉德反应而产生大量类黑素的样品在后期烘干处理时应该考虑采用适宜的温度来烘干外表水分。

2.3 HPLC检测游离氨基酸及美拉德反应中间产物的结果

2.3.1 样品中游离氨基酸的检测结果

按照实验条件中的色谱条件，将处理好的样品溶液进行高效液相色谱分析，得到色谱图，再对所得的结果进行计算分析如表2所示。由表2可知，异常样品中的赖氨酸和甘氨酸含量明显比正常样品高，而多数正常样品的半胱氨酸含量较异常样品的高。赖氨酸最易于发生美拉德反应可获得更深的色泽。而且在美拉德反应中甘氨酸含量增加时，色素形成迅速增加。但是，半胱氨酸反应后获得色泽最浅。异常样品中增色较强的物质如赖氨酸、甘氨酸含量都比正常样品的高；增色较弱的半胱氨酸含量较正常样品低，增色强的氨基酸多而增色较弱的氨基酸略少，从而增色效果相对更为显著。这也是异常样品颜色比正常样品更深的原因。除此之外，其他易于发生美拉德反应的氨基酸（如天冬氨酸、精氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等）在多数异常样品中的含量都明显比正常样品高。因此，结果表明随着烘干处理样品的温度升高，样品中的大多数游离氨基酸含量在整体水平上也随之增加。

2.3.2 5-HMF、糠氨酸和糠醛的检测结果

高效液相色谱检测样品中美拉德反应中间产物的含量如表3所示。由表3可知，异常样品的美拉德反应中间产物糠氨酸、糠醛和5-羟甲基糠醛均比正常样品偏高。这说明异常样品中的美拉德反应比正常样品中的剧烈，从而表明异常样品产生的美拉德反应最终产物类黑素也比正常样品的高，并经过高温烘干过程使得类黑素黑化程度加深，这可能是中药口服液出现黑色沉淀的原因，同样也说明烘焙温度影响美拉德反应发生程度，从而影响重要中药口服液质量。

2.3.3 美拉德反应不利中间产物丙烯酰胺的检测结果

丙烯酰胺形成的最佳温度为140～180℃，并在一定的范围内，随着温度的增加丙烯酰胺生成量也在逐渐增加，即在一定范围内丙烯酰胺的生成量与温度成正比[19]。而中药口服液的制作原材料主要是由低脂肪、高碳水化合物的植物类构成，因此在高温条件下也能形成丙烯酰胺这种有害的美拉德中间产物。

样品中的丙烯酰胺含量结果如图4所示。由图4可知，正常样品中的丙烯酰胺含量明显低于异常样品，这就说明高温处理会使得中药样品美拉德反应中间产物丙烯酰胺含量明显增加，从而影响产品品质及安全。因此，适当控制美拉德反应的温度，才能更好保证中药口服液的风味和品质，并提高其安全性。

3 结论

本研究比较分析了不同烘焙温度对中药口服液中美拉德反应产物生成的影响。结果表明，高温烘焙条件下均会增加还原糖、蛋白质含量、氨基酸含量以及美拉德中间产物糠氨酸、糠醛、5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺含量，美拉德反应程度随样品烘干温度升高而增加。高温烘干处理不利于中药口服液样品的安全性。从实验结果及样品外观呈现综合而言，样品烘干温度50℃较100℃更为适合中药口服液的产品品质及安全性。因此，在中药口服液的生产过程中，选择适宜的温度对控制美拉德反应程度至关重要，进而可以有效控制美拉德反应不利中间产物的量。但是，50℃的烘干处理温度在工业应用中所需的烘干时间太长，从工业生产成本方面来说更适合的烘干处理温度有待进一步研究，此外，美拉德反应程度及产物除了与反应温度有关外，还与时间、pH值、溶剂、原材料等有重要关系。所以，其他的影响因素对美拉德反应程度及产物的影响，也有待于深入研究。

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LI Sha1,GUO Dong2,WANG Xiaowen1,ZHU Wanjun2,LUO Lixin1*
(1.School of Bioscience and Bioengineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006,China; 2.Infinitus(China)Co.,Ltd.,Jiangmen,529156,China)

The compounds produced by Maillard reaction in normal and abnormal oral liquid of traditional Chinese medicine(TCM)were analyzed by HPLC,and their effects on oral liquid quality were evaluated.The results showed that the contents of reducing sugar,protein,Maillard reaction products including furosine,furfural,5-hydroxymethylfurfural and acrylamide;as well as the contents of amino acids such as lysine,glycine and leucine in abnormal samples were all obviously higher than in normal samples.The melanization degree of melanoid extracted by different temperature strengthened with the increase of temperature.The degree of Maillard reaction also increased with a rise of drying temperature,therefore,high temperature is not conductive to the safety of the oral liquid of TCM.

traditional Chinese medicine;HPLC;Maillard reaction products;melanoid;5-hydroxymethyl-furfural

TS262.5

A

0254-5071（2015）04-0030-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.008

2015-03-20

国家自然科学基金资助项目（31271924）

李沙（1988-），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物检测。

*通讯作者：罗立新（1966-），教授，博士，研究方向为微生物学及发酵。