DNA分子遗传标记技术在仓储害虫中的研究与应用

伍 祎 李志红 李燕羽 张 涛 曹 阳

（国家粮食局科学研究院1，北京 100037）（中国农业大学农学与生物技术学院2，北京 100093）

DNA分子遗传标记技术在仓储害虫中的研究与应用

伍 祎1，2李志红2李燕羽1张 涛1曹 阳1

（国家粮食局科学研究院1，北京 100037）（中国农业大学农学与生物技术学院2，北京 100093）

DNA分子遗传标记的产生和发展，为从分子水平研究重要经济昆虫提供了全新的技术和手段。仓储害虫在农业经济中占有重要地位，通过对仓储害虫遗传物质的研究和分析，能够从生命的本质上探索仓储害虫的系统发育、遗传结构和进化机制等问题，为害虫综合治理策略提供理论支持。在仓储害虫中，分子标记研究起步较晚，研究的重点主要是鞘翅目和啮虫目害虫。回顾、分析了DNA分子标记技术在仓储害虫中的研究与应用，包括仓储害虫种类鉴定、系统发育、种群遗传多样性及抗药性等，并对该技术的研究前景进行了展望。

分子标记 仓储害虫 粮食储藏

仓储害虫是危害储藏期间粮食及其产品的害虫和害螨的统称。截至2000年，全世界已记载的仓储昆虫和螨类约500种，我国有383种，其中仓储昆虫242种，螨类141种[1]。仓储害虫对产后粮食带来巨大损失，据1990～2000年的调查，全世界粮食每年由于仓储害虫危害而造成的损失大概有5%～10%，约1亿8千万t，在一些热带和亚热带国家，粮食收获后有20%或者更多的损失是由仓储害虫造成[2－3]。近年来，在世界范围内仓储害虫对磷化氢抗药性越来越强，种类也日趋增多，导致熏蒸失败，并且引起了粮食有害化学药剂残留等一系列问题[4]。另外，港口截获仓储害虫的种类快速鉴定，来源追溯等问题也亟待解决。害虫分子水平上遗传学和进化策略的研究是解决害虫问题的基础，运用DNA分子遗传标记研究仓储害虫，从分子水平了解害虫遗传变异的本质具有重要意义。

1 分子遗传标记在仓储害虫中研究的意义和内容

20世纪90年代以来，分子遗传标记的产生、发展及其广泛应用，为从分子水平研究昆虫提供了全新的技术和手段。通过对昆虫遗传物质的研究和分析，能够了解昆虫的系统发育、遗传结构和进化机制等问题，能从生命的本质上探索昆虫的遗传进化，为研发新型生物防治技术和综合治理策略等提供理论支持。在仓储害虫中，分子标记研究起步较晚，某些新兴的分子标记应用还处于起步阶段，运用的分子技术主要是基于PCR的基因序列分析和微卫星DNA标记，研究的对象主要是仓储中危害严重的鞘翅目、啮虫目以及蛛形纲的螨类等。目前，许多研究者利用分子遗传技术对仓储害虫进行种类鉴定，系统发育分析，种群遗传研究，害虫抗药性水平，以及害虫的入侵起源与入侵规律分析等。

2 DNA分子遗传标记在仓储害虫中的研究进展

2.1 仓储害虫种类鉴定研究

传统的昆虫种类鉴定技术普遍以成虫形态特征为依据，需要严格的专业知识学习和培训，而且很难对未成熟虫态（卵、幼虫及蛹）、残损样品以及形态相似种类进行快速鉴定。现代分子技术的发展，尤其是DNA条形码技术的出现和完善，为物种准确快速鉴定开辟了新方法，同时从基因水平反映物种的进化关系，在提高物种鉴定效率、发现新种和隐存种等方面具有重要应用价值。在仓储害虫中，已成功运用随机扩增多态性（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、DNA条形码和基于PCR特异引物技术实现了物种的快速鉴定。

RAPD是仓储害虫中较早应用的分子鉴定技术，实现了拟步甲科和锯谷盗（Oryzaephilus surinamensis）的鉴定[5－6]。鞘翅目是仓储害虫中危害最为严重的一大类群，有些种类形态非常相似，如米象（Sitophilus oryzae）和玉米象（Sitophilus zeamais），Hidayat等[7]运用RFLP技术，扩增了一段mtDNA上1 635 bp基因，结合3种限制性内切酶成功将两者区分开来。书虱是啮虫目中体形微小的一类害虫，形态鉴定难度大。Qin等[8]采用 PCR－RFLP技术，通过扩增一段的16S rDNA基因，鉴定了中国和捷克4种书虱，其中3种书虱产生了地理隔离，为鉴定书虱不同地理来源提供了技术依据。Li等[9]结合形态和16S rDNA基因序列的方法成功实现了嗜卷书虱（Liposcelis bostrychophila）不同地理种群的快速鉴定，这主要是因为某些物种在长期的进化中，由于外界因素（温湿度、光照以及地形地貌等）产生了地理隔离，这种变异在基因水平上表现出来，通过分子技术手段得到直观的体现。

分类学家 Hebert等[10]首次提出“生物条形码”的概念，认为线粒体COI基因一段约700 bp的片段可作为动物DNA条形码的基础，其基本原理在于，假设DNA序列改变率为2%每百万年，600 bp的序列中就有12个可识别的碱基差异，而多数物种进化历史均超过一百万年，理论上可以完成所有物种的分析和鉴定。经证实，超过95%的被测动物类群具有明显区分的条形码序列[11－12]。近年来，DNA条形码技术已逐步应用在仓储害虫的种类鉴定中[13]，该方法具有简便、快速、专一的优点。

Obrepalska－Steplowska等[14]为了将谷象（Sitophilus granaries）与米象和玉米象区分开来，针对COI条形码基因和COII基因设计了谷象的特异引物。林阳武[15]针对线粒体上Cytb基因，设计了菜豆象（Acanthoscelides obtectus）、四纹豆象（Callosobruchusmaculatus）、绿豆象（Callosobruchus chinensis）特异性引物，建立了这三种害虫的分子鉴定技术体系。在书虱的研究中，目前已经针对16S rDNA和COI基因设计出了嗜虫书虱（Liposcelis entomophila）、啮书虱（Liposcelis corrodens）和Lepinotus reticulatus的特异引物对[16－18]，能将其与常见仓储书虱鉴定开来。另外，Wei等[19]针对ITS全序列设计了一组特异引物对中国常见的6种仓储书虱进行快速鉴定，经一个多重PCR反应便能区分6种仓储书虱。蛛形纲的螨类是仓储害虫中肉眼很难看见的一个类群，种类丰富，在螨类的分子鉴定中，Webster等[20]利用COI的部分片段对粉螨属中粗脚粉螨（Acarus siro）及其亲缘种小粗脚粉螨（Acarus farris）和静粉螨（Acarus immobilis）作了种类鉴定。

目前，快速鉴定是分子技术在仓储害虫中应用最广的研究内容之一，涉及到的分子标记包括RAPD、RFLP、基于DNA条形码设计特异引物技术。在种类鉴定方面，这几种分子标记技术有其自身的特点，RFLP是发展最早的DNA标记技术，结果直观明了，但是检测周期长，操作技术要求较高，如克隆的制备、同位素标记、Southern印记反应及分子杂交等技术。RAPD技术简便易行、省时省力，但是结果重复性差，为了得到较稳定的结果，各种反应参数必须事先优化选择。基于DNA条形码设计特异引物技术是近年来国际上普遍应用的技术，其准确性高、重复性好、操作简单、且适合于高通量的检测，但是特异引物的鉴定也有其自身的局限性，引物特异性的测试是在一定相似物种范围内进行的，当相似物种数增加时，可能会产生非特异的扩增，因此在测试某物种的特异引物时，要尽可能多的包含其近似物种的种类，以保证其种类鉴定的准确。因此，在对仓储害虫进行分子鉴定时，要综合考虑测试要求、成本、操作难易等因素，选择合适的标记技术。

2.2 仓储害虫系统发育研究

生物基因组中含有特别丰富的生物学信息，用基因研究昆虫的系统发育，更有可能比较真实地反映出昆虫的进化历史。系统发育研究是DNA分子标记的技术优势，在仓储害虫系统发育的研究中，鞘翅目和啮虫目是研究的重要对象，主要采用基于PCR扩增的序列分析技术，针对线粒体和核糖体基因进行分析，构建仓储害虫系统发育关系。

鞘翅目的研究中，黄永成等[21]、李伟丰等[22]测定了长蠹科害虫长度为204 bp的线粒体ND4基因序列，并将分子特征与形态学特征比较分析，探讨种、属的系统进化。王银竹等[23]分析了长小蠹科系统发育关系，研究结果表明分子水平的亲缘关系与Wood（1993）新修订的分类系统基本一致，说明长小蠹科的新分类系统可能更趋于合理。刘晓丽等[24]测定了9种拟步甲长度为435 bp的16S rDNA部分基因序列，构建了分子系统树，结果表明分子水平的亲缘关系与传统的分类观点相吻合。Alvarez等[25]对同一地域分布的巴西豆象（Zabrotes subfasciatus）和几种三齿豆象属豆象的12S rRNA、Cytb、COI基因进行研究，发现了巴西豆象Cytb基因序列中有外源基因，寄生于豆象的真核生物或原核生物是造成基因转移主要原因。Tuda等[26]运用3个线粒体基因，采用序列分析的方法，重建亚洲和非洲地区的瘤背豆象属系统发育。

对书虱和螨类的分子系统发育研究是国外相关研究者普遍关注的焦点。Johnson等[27]联合核糖体和线粒体基因片段，重建了啮虫亚目的系统发生关系，明确了啮虫目的系统发育关系以及啮虫目与虱目的关系。吴太葆等[28]针对一段mtDNA COI基因序列，分析了椭圆食粉螨（Aleurolyphusovatus）2个中国地理种群，未发现地理差异。张素卿[29]基于2个核糖体基因对肉食螨亚科常见的2属4种肉食螨[马六甲肉食螨（Cheyletusmalaccensis）、强壮肉食螨（C．fortis）、转开肉食螨（C．aversor）及磷翅触足螨（Cheletomorpha lepidopterorum）]的系统关系进行分析，认为马六甲肉食螨和强壮肉食螨是同物异名种。

仓储害虫系统发育研究中，研究的重点已经不只是生物的形态学特征，而是生物大分子尤其是序列。在仓储害虫研究中，由于不同基因片段有其自身的进化速率，同时不同的仓储害虫科属间系统进化速度也不一样，针对不同研究对象选取不同的基因片段尤为重要。通过系统发育分析推断或者评估这些进化关系，以进化树的形式描述同一谱系的进化关系，包括了分子进化（基因树）、物种进化以及分子进化和物种进化的综合。分子标记技术的介入，为全面理解仓储害虫不同阶元的进化关系提供了有力的技术方法。

2.3 仓储害虫种群遗传研究

种群遗传研究主要涉及生物入侵的起源探索、群体爆发判别、扩散路径预测及入侵机理等内容。种群遗传学中应用最为广泛的分子技术主要是DNA序列分析和微卫星DNA技术，该类研究是进一步揭示昆虫尤其是重要害虫种类入侵来源和扩散问题的基础[30]。

基于微卫星DNA标记技术是分子技术中开发较晚的方法，是种群遗传研究的首选。在鞘翅目中，Sembene等[31]研究了塞内加尔5种寄主上的花生豆象（Caryedon serratus）的微卫星DNA，从而确定了其微卫星位点的多态性。Alvarez等[32－34]筛选了黑翅豆象（Acanthoscelides obvelatus）和菜豆象的微卫星多态性位点，并运用微卫星标记和3个mtDNA基因序列分析相结合的方法，对采自6个国家的菜豆象的进行了遗传分析，结果表明菜豆象起源于秘鲁，由秘鲁传入墨西哥最终进入旧大陆的入侵规律。在巴西豆象的种群遗传的研究中，Aebi等[35－36]应用微卫星标记技术，发现了地理隔离与寄主是影响巴西豆象及其天敌群体遗传结构的最为重要的因子。在啮虫目书虱研究方面，目前，已从无色书虱（Liposcelis decolor）、嗜卷书虱和嗜虫书虱的基因组DNA中成功分离出微卫星位点[37－38]，并且运用6个微卫星位点分析了澳大利亚无色书虱的种群遗传结构及其扩散途径[39]。螨类的研究中，Zou等[40]利用微卫星标记研究了中国4个种群的粗脚粉螨，发现粗脚粉螨已经产生地理隔离，但遗传距离与地理距离不存在相关性。

基于DNA序列分析研究种群遗传是仓储害虫中普遍采用的研究方法。鞘翅目中，Tuda等[41]针对绿豆象一段522 bp的线粒体基因COI序列，分析了来自3个国家的8个地理种群，结果表明绿豆象可能已频繁入侵日本。许佳君[42]、顾杰等[43]研究了蚕豆象（Bruchus rufimanus）、豌豆象（Bruchus pisorum）、绿豆象和四纹豆象不同地理种群种间亲缘关系，结果表明种群间的遗传分化程度较低。Blanc等[44]首次运用RFLP技术研究烟草甲（Lasioderma serricorne）15个国家16个地理种群的结构，发现地理距离不明显，商品贸易等人为行为是形成烟草甲种群结构的主要原因。啮虫目中，魏丹丹[45]采用Cytb基因片段为分子标记，对中国10个嗜虫书虱地理种群及8个嗜卷书虱地理种群的遗传结构进行分析，研究发现两性生殖的嗜虫书虱具有更高的遗传多样性，地理隔离不是两种书虱种群间遗传分化的主要原因。

仓储害虫的种群遗传研究中，普遍是序列分析和微卫星标记2种技术相结合。通过分子标记技术对仓储害虫种群遗传研究的现状分析，可以看出仓储害虫由于其生活的特殊环境，其分子水平的遗传分化普遍偏低，其传播和扩散基本是依赖人为活动，如粮食及食品的运输。因此，要防止仓储害虫的进一步危害，必须要加强粮食调运的前期的检疫处理和后期贸易监管。

2.4 仓储害虫抗药性和共生菌研究

仓储害虫多数是发生在粮库这样的特定场所，粮库的类型（平房仓、浅圆仓），粮库里的熏蒸处理，粮库中特有的温湿度环境以及仓储害虫自身共生菌等，这些因素对仓储害虫的遗传水平，种群变化产生重要影响。了解清楚这些问题将对仓储害虫的防治管理提供基础理论支持。

熏蒸处理是粮库中常用的防治手段，这导致了仓储害虫抗药性的产生，随着分子遗传标记技术的发展，人们能够在分子水平上进一步了解害虫的抗药性机制，这将对害虫的防治起到极大的推进作用。目前，仓储害虫磷化氢抗性的研究中，Schlipalius等[46]发现了谷蠹（Rhizopertha dominica）和赤拟谷盗（Tribolium castaneum）中与磷化氢抗性密切相关的脱氢酶二聚体（DLD），该酶是毒素降解的核心酶，而线虫的突变体中DLD增加了对亚砷酸盐敏感性，这为解决害虫抗磷化氢的问题提供了理论依据。线粒体是呼吸作用场所，是能量代谢的重要细胞器，普遍认为线粒体是害虫抗药性的作用位点，Corrêa等[47]研究了玉米象中线粒体谱系、线粒体裂解和呼吸频率与磷化氢抗药性的关系，研究发现线粒体谱系和磷化氢的敏感性之间没有任何关系，线粒体上的COI和COII基因片段并不是磷化氢易感性的有效分子标记。在我国，宋旭红[48]研究了谷蠹不同地理种群对磷化氢抗性及其遗传分化，结果表明粮食加工企业的种群具有高抗性，而地方粮库的种群抗性较低；分子标记分析表明谷蠹种群的遗传变异与地理位置、仓库类型及储粮生态区不相关。Sharaf等[49－51]测定了锯谷盗的基因组，并分析了自然种群和仓库种群基因组差异，发现自然条件的锯谷盗种群比粮仓中的种群表现出更高的遗传差异水平，推测锯谷盗种群遗传结构与其繁殖方式有关。研究表明，仓储昆虫的抗药性和遗传多样性与自然条件下的昆虫有明显差异，在对仓储害虫分子生物学的研究和防治管理中，需要考虑粮库这样一个特定环境，对不同的种群采用不同的防治手段才能取得更好效果。

昆虫内共生菌与昆虫宿主生物学密切相关，内共生菌能够影响昆虫宿主的种群适合度、入侵能力、适应能力、竞争能力甚至进化等[52]。在仓储害虫内共生菌的研究中，Kageyama等[53]通过对仓储害虫Wolbachia共生菌wsp基因检测，在38种59个品系储粮害虫中，发现13种18个品系的储粮害虫感染有Wolbachia共生菌，至少6个Wolbachia共生菌品系在多种储粮害虫中共享。Hubert等[54]研究了4种仓储害螨体内的共生菌，不同的害螨共生菌种类不一样，且共生菌的遗传分化明显。目前，仅检测了某些仓储害虫内共生菌的种类，进一步的仓储害虫与共生菌相互作用和影响机理研究有待加强，以期为运用共生菌来防治仓储害虫提供基础数据。

3 展望

DNA分子标记在短暂的几十年，经历了迅猛发展，各种标记日趋成熟，新的标记出现和完善周期也迅速缩短，DNA分子标记技术已广泛的应用于仓储害虫各个阶元的研究中，如系统学、群体遗传学、入侵学和抗性机制等。在已经出现的几十种分子标记中，基本是建立在RFLP、PCR和重复序列的基础上，每种标记有其自身的特点和运用侧重点。

仓储害虫对收获后的农产品造成巨大的损失，在我国农业经济发展中占有十分重要的地位，全面掌握仓储害虫分子生物学基础数据是国家进一步做好“广积粮、积好粮、好积粮”的重要环节，是实施科技兴粮战略的重要内容。但由于目前技术水平、数据分析及人员投入等方面的限制，仓储害虫DNA分子标记研究仍未广泛开展，未来仓储害虫分子技术的研究重点建议考虑以下几个方面：1）仓储害虫快速鉴定研究，构建DNA条形码数据库，开发仓储害虫DNA条形码鉴定系统，实现粮堆和食品加工中害虫尸体和碎片的快速鉴定，为绿色储粮、虫情监测等提供基础技术保障；2）仓储害虫种群遗传结构研究，仓储害虫随着粮食调运以及自身的飞翔等因素进行入侵和扩散，种群遗传规律研究，可以明确入侵来源、扩散趋势、扩散路线等，为在虫情监测、粮食调运和害虫管理提供理论依据；3）仓储害虫抗药性研究，仓储害虫抗药性是日益紧迫的世界性问题，对一种或多种熏蒸剂产生抗药性的昆虫及螨类数量日趋增多，DNA分子技术能为抗药性的监测、检测、机理、评价、治理等问题提供技术方法；4）仓储害虫生物防治技术研究，运用分子标记技术检测粮库中害虫天敌（如捕食螨、米象金小蜂、麦蛾茧蜂、黄褐色食虫蝽及窗虻等）品系，辅助选择最优品系天敌，评估各种天敌对粮库中生物多样性影响等。这些研究能补充和完善仓储害虫分子遗传数据，为仓储害虫进化生物学的研究提供更丰富的理论依据，为害虫综合治理新技术、新方法研发奠定科学的应用基础。

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The Research and Application of Dna Molecular Genetic Markers in Stored－Product Pests

Wu Yi1，2Li Zhihong2Li Yanyu1Zhang Tao1Cao Yang1

（Academy of State Administration of Grain1，Beijing 100037）（College of Agronomy and Biotechnology，China Agricultural University2，Beijing 100193）

DNA molecular genetic markers provided a new technique and method for the research of important economic insects onmolecular level.Stored－product pests played an important role in the agricultural economy.The research and analysis on genetic material of stored－product pests had revealed phylogenetic development，genetic structure and evolution mechanism from the essence which could afford a theoretical support for the integrated pest management strategy.The DNA molecular genetic markers had shorter history on applying in stored－product pests.The coleoptera and psocoptera pestswere themain research objects in the previous study.In the paper，the current study and application of DNA molecular geneticmarkers in stored grain insectwere summarized，including species identification，phylogenetic relationships，population genetic variation and resistance.Also the application prospects of DNA molecularmarkers in stored－product pestswere discussed in details.

DNA molecularmarkers，stored－product pests，grain storage

Q1

A

1003－0174（2015）10－0140－07

教育部国家国际科技合作专项（2013DFG32350），北京市自然科学基金（6122020）

2014－04－18

伍祎，女，1980年出生，博士，植物保护

曹阳，男，1958年出生，研究员，粮油储藏