动物源性大肠埃希菌超广谱β—内酰胺酶的检测及耐药性研究

周敬纲

[摘要] 目的 了解动物源性大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的检出率和耐药特点，为其耐药性的安全评价提供依据。 方法 采用NCCLS推荐的表型检测法和确认试验测定大肠埃希菌ESBLs，纸片扩散法测定大肠埃希菌的耐药性。 结果 222株大肠埃希菌对环丙沙星（83.78%）、诺氟沙星（92.79%）、利福平（81.08%）的耐药率很高；对阿米卡星、亚胺培南高度敏感。ESBLs检出率为12.16%（27/222），产ESBLs菌株除对亚胺培南外其余13种抗生素的耐药率均高于非产ESBLs菌株。 结论 动物源性大肠埃希菌对很多抗生素具有一定的耐药性，应加强对食品中动物源性大肠埃希菌耐药性的监测。

[关键词] 大肠埃希菌；动物源食品；耐药性

[中图分类号] R378.2+1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）12（b）-0008-04

食品安全是全世界普遍关注的问题，其关系到人民群众的身体健康和生命安全。近年来，由于抗生素的滥用，出现越来越多的耐药菌株，且耐药谱越来越广[1]，对感染性疾病的临床治疗构成威胁。大肠埃希菌是食品污染监测的主要指标菌，是人类和动物肠道中的正常栖居菌，具有致病性，条件致病性和非条件致病性等多样性特点，临床上，大肠埃希菌引起感染的现象日趋严重，耐药菌株不断增多，其中产超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum beta-lactamases，ESBLs）大肠埃希菌是对β-内酰胺类抗生素耐药的主要病原菌。在动物源性食品的加工过程中，很容易受到大肠埃希菌的污染，并传递给人类，因此对动物源性大肠埃希菌耐药性和ESBLs检测具有重要意义。本文通过对食品污染风险监测中由动物源性食品中分离到的大肠埃希菌进行药敏试验，了解本地动物源性食品中大肠埃希菌的耐药性和ESBLs的产生情况，为临床抗生素应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

2011年6月～2013年9月食品污染风险检测中源自鸡源、猪源、牛源食品中的大肠埃希菌222株，其中鸡肉源72株，鸡蛋源53株、猪肉源82株、牛肉源10株、生牛奶源5株。

1.2 菌株的分离程序

1.2.1 样品的稀释 取动物源食品25 g放入盛有225 ml磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2 min制成1∶10的样品匀液。调pH值至6.5～7.5。用1 ml无菌吸管吸取1∶10样品匀液1 ml，沿管壁缓缓注入9 ml磷酸盐的缓冲液，混匀，制成1∶100的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。

1.2.2 初发酵试验 选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1 ml，（36±1） ℃培养（24±2） h，产气管进行复发酵试验。

1.2.3 复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中取培养物1环，移种于已提前预温至45℃的EC肉汤管中，放入带盖的（44.5±0.2） ℃水浴箱内，水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养（24±2） h，产气管，进行EMB平板分离培养。

1.2.4 EMB平板分离 用接种环取培养物划线接种于EMB平板，（36±1）℃培养18～24 h，挑取具黑色中心有金属光泽或无金属光泽的典型菌落进行鉴定。

1.2.5 鉴定 IMViC实验，选取结果为﹢﹢﹣﹣、﹣﹢﹣﹣、﹢﹢﹣﹢、﹣﹢﹣﹢的目标菌落进行ESBLs检测和药敏试验。

1.3 ESBLs检测

ESBLs表型检测方法，采用美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的标准纸片琼脂扩散法，确认试验采用双纸片法，抗生素为头孢他定30 μg，头孢他定/克拉维酸30 μg/10 μg，头孢噻肟30 μg，头孢噻肟/克拉维酸30 μg/10 μg。培养基为M-H琼脂。结果判读：任何一种药物在加入克拉维酸后，抑菌圈直径与不加入克拉维酸的抑菌圈相比增大值≥5 mm，判断为产ESBLs大肠埃希菌。

1.4 药敏试验

采用VITEK32细菌鉴定仪对分离菌株进行鉴定，纸片扩散法（K-B法）进行药敏试验，药敏试验质控菌株为大肠埃希菌（ATCC25922）。抗生素选择如下。青霉素类：氨苄西林（AMP）；头孢菌素类：头孢噻吩（CFT）、头孢曲松（CTX）；氨基糖苷类：庆大霉素（GEN）、阿米卡星（AMK）；四环素类：四环素（TET）、强力霉素（DOTC）；氯霉素类：氯霉素（CHL）；磺胺类：甲氧苄啶（TRI）；甲氧苄啶/磺胺甲唑（SXT）；喹诺酮类：环丙沙星（CIP）、诺氟沙星（NOR）；碳青霉烯类：亚胺培南（IPM），其他：利福平（RIF）。试验结果按NCCLS标准判定。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行处理，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药敏试验结果

222株大肠埃希菌对CIP（83.78%）、NOR（92.79%）、RIF（81.08%）的耐药率很高；对GEN（32.43%）、SXT（12.16%）耐药率较高；对AMP（9.01%）、CFT（6.31%）、CTX（4.95%）、TET（7.21%）、DOTC（4.50%）、CHL（5.41%）、TRI（3.60%）的耐药率介于3.60%～9.01%；对AMK（0.90%）、IPM（0.00%）高度敏感。猪肉源和牛肉源大肠埃希菌对GEN的耐药率相对较高，达到60.98%、100.00%（表1）。

表1 动物性食品源大肠埃希菌对14种抗生素的耐药率[株（%）]

2.2 动物性食品源大肠埃希菌ESBLs检测结果

222株大肠埃希菌中ESBLs检出率为12.16%（27/222）。样品ESBLs分布：鸡肉源12.5%（9/72），鸡蛋源11.3%（6/53）、猪肉源12.2%（10/82）、牛肉源10.0%（1/10）、生牛奶源20.0%（1/5）。

2.3 产与非产ESBLs大肠埃希菌耐药率的比较

除IPM外，产ESBLs菌株对其他13种抗菌药物的耐药率均明显高于非产ESBLs菌株（P<0.05）（表2）。

表2 产与非产ESBLs大肠埃希菌耐药率的比较 [株（%）]

3 讨论

大肠埃希菌为革兰氏阴性短杆菌，是人和动物肠道中的正常栖居菌，分为致病性大肠埃希菌和非致病性大肠埃希菌，后者又称为普通大肠埃希菌，是人和动物肠道中兼性厌氧正常菌群的优势菌种，通常对机体无害。当在外界环境发生变化、机体免疫力下降或其他病原菌感染等条件下，可引起继发感染。随着对其所致疾病研究的增多，发现其所致感染性疾病居各种常见细菌性感染疾病的首位[2]，由于抗生素滥用，近年来动物和人类大肠埃希菌的耐药性逐渐增高[3]，在畜牧养殖业过程中，无论抗菌药物是作为治疗用还是作为促生长剂用，在抗菌药物的选择性压力下，肠道细菌很易产生耐药性变化[4-6]。

研究表明动物源性大肠埃希菌的耐药率与养殖场抗菌药的使用剂量、频率存在很强的相关性[7]。本试验结果显示，动物源性食品大肠埃希菌对动物常用抗生素CIP、NOR、RIF的耐药率很高，达到81.08%～92.79%；对AMP、CFT、CTX、TET、DOTC、CHL、TRI的耐药率介于3.60%～9.01%；对AMK和IPM高度敏感。与人类临床大肠埃希菌耐药性不尽相同[8-10]，耐药性CIP、RIF高于临床，敏感性IPM、AMK与临床相似，其余抗生素临床分离大肠埃希菌菌株的耐药性要高于本实验结果。研究表明动物源性食品分离的大肠埃希菌已对多种抗生素具有一定的耐药性，提示动物临床用药应根据药敏试验结果，有针对性地使用，同时要首选不容易诱导细菌产生耐药性的药物，而且必须经常更换抗生素种类，以免产生新的耐药菌株。

ESBLs是一类能水解广谱青霉素，第三代头孢菌素及单环β-内酰胺酶类抗生素的β-内酰胺酶，使产酶菌在有β-内酰胺酶抗生素存在条件下能继续生存，但对碳青霉烯类及酶类抑制剂敏感。另外，产ESBLs菌不仅对第三代头孢菌素和氨曲南耐药，而且对氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类抗菌药物也可交叉耐药，所以产ESBLs细菌的治疗已成为临床上一大难题，其耐药基因可以通过接合、转化、转导等形式在同种属，甚至不同种属间传递，造成耐药性在细菌间传播[11]，给临床感染的控制带来困难。虽然本试验ESBLs检测结果（12.16%）低于临床菌株（41.42%～69.2%）[8-10，12]，但说明在动物源性食品中大肠埃希菌具有一定的ESBLs菌株，应引起重视。产ESBLs菌株对除IPM外其余13种抗生素的耐药率高于非产ESBLs菌株（P<0.05），与临床相似[8]，表现为ESBLs阳性菌较ESBLs阴性菌具有较高耐药性[13]。

试验结果显示，动物源性大肠埃希菌对很多抗生素已具有一定的耐药性。尽管目前尚无有力证据证明动物源性食品耐药大肠埃希菌菌株可以通过食物链诱发人体疾病，但是摄入人体的动物性食品源耐药大肠埃希菌菌株把人体肠道作为临时寄居地，很可能把耐药基因转移至人体肠道正常菌群中，这种耐药基因在细菌间传播，是多重耐药病原菌不断产生的重要原因[11，14]，肠道菌群，尤其是大肠埃希菌在温血动物肠道内密度大，被认为是食源性肠道病原菌多重耐药基因的主要储存库[15]，携带耐药基因的大肠埃希菌与共生的沙门菌、致病性大肠埃希菌及其他肠道病原菌通过可移动基因元件的转移进行基因物质的交换[16-18]，使各种药物敏感菌产生耐药性，甚至引起“超级细菌”的产生，有报道显示，自链霉素作为助长剂应用于畜牧生产时，大肠埃希菌中出现控制耐药性可转移质粒，这种质粒曾在猪、饲养员及其家人分离的大肠埃希菌中被发现，也在人群肠道分离的大肠埃希菌中被发现[19]，但这些人群从未与养猪场接触，只是住同一地区[20]，这提示耐药菌质粒可以从动物性食品以食物链的方式传入人体。

总之，作为大肠埃希菌耐药性菌株产生的主要来源之一，应加强动物源性食品大肠埃希菌的耐药性检测，为相关从业者和部门提供参考依据，减少动物源性食品作为耐药病原菌的潜在“蓄水池”。

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（收稿日期：2014-10-09 本文编辑：李亚聪）