P2X7 受体与基因转录的关系①

习德娥 韩 莉 谭 超 杨晓东 (三峡大学第一临床医学院，宜昌4 430001)

核酸受体P2X7 在一些炎症、骨和神经细胞中表达，被组织损伤、炎症和感染部位释放的ATP 激活后引起许多细胞反应如钙离子内流、MAPK 活化、炎症介质释放和凋亡，是炎症和神经系统疾病的一个有希望的治疗靶点和潜在的生物标志物。许多研究把焦点集中于P2X7 受体在细胞死亡和介质处理中的作用(例如炎症小体裂解IL-1 前体)，但是P2X7 受体与基因转录调控的关系很少有报道。这篇综述重点介绍P2X7 受体与基因转录的关系。

1 P2X7 受体的结构和功能

P2X7 受体由595 个氨基酸组成，包含一个短的胞内N 端区域，2 次跨膜域，一个大的胞外配体结合域及一个对脂质和相应的胞浆蛋白表达有重要作用的胞内C 端结构域。此受体有N-连接糖基化位点，残基N187 位于两个会减弱P2X7 受体功能的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)—E186K 和L191P 附近，其糖基化对细胞表面的受体表达和正常功能的发挥至关重要［1］。P2X7 受体还包括胞内的棕榈酰化位点，这些位点与细胞膜的耐去污剂特性有重要关系［2］。P2X7 受体与其他的P2X 家族成员不同，其C 端尾比其他的P2X 受体至少长100 个氨基酸，是P2X 受体中促进非特异性孔道形成的受体之一。P2X7 的持续性激活导致可逆的孔道(允许分子量＜900 Da 的小分子通过)的形成。在某些特定的环境中，孔道形成与凋亡的诱导有关。最近研究发现P2X7 受体受到配体的短暂刺激后，将导致基因转录的改变而不是细胞死亡［3，4］。

2 P2X7 受体与基因转录因子

P2X7 的配体能够刺激一些转录因子的表达、活化和/或核易位，这些转录因子包括早期生长反应家族(Egr-1、Egr-2 和Egr-3)成员、活化的T 细胞核因子(NFAT)，核因子-κB(NF-κB)家族成员，循环AMP 反应成分(CRE)结合蛋白(CERB)和AP-1 家族成员c-Fos，FosB，JunB。

2.1 Egr 早期反应因子(The early growth responsive gene，Egr)为重要的核转录因子，激活后与靶基因启动子上特异的结合位点作用而调控下游靶基因的转录表达，参与从细胞的生长增殖到分化以及凋亡等相关的多种基因的表达。锌指转录因子Egr-1、Egr-2、Egr-3 是在炎症中扮演重要角色的早期基因，在许多细胞中促有丝分裂信号能诱导其表达［5］。Egr-1 基因编码一个80～82 kD 的锌指转录蛋白，通过与特异的DNA 序列或者与转录复合物上的转录调节物作用控制基因转录，参与细胞生长、增殖、分化和基质修复以及B 细胞和T 细胞的活化［6-8］，但Egr-2 和Egr-3 被认为促进T 细胞的失能［9］。最近有报道称P2X7 配体促进这些因子的表达［10］。Stefano 等［11］使用表达P2X7 的HEK293细胞证实BzATP 能通过活化ERK1/2 和转录因子Elk-1 促进Egr-1 转录的上调，支持P2X7 的活化影响基因的转录这一观点。Friedle 等［10］发现BzATP 能够诱导N9神经胶质细胞和初级神经胶质细胞中Egr-1、Egr-2、Egr-3 的表达。Egr RNAi 导入N9 神经胶质细胞后，BzATP 诱导的IL-6 的表达减少，LPS 和BzATP 共同诱导的TNF-a 的产生也减少。而且，有报道发现Egr-1 使VEGF 在肺癌细胞中的表达成为可能［12］，暗示我们观察到的人单核细胞中的P2X7 依赖性的VEGF 表达可能通过Egr-1 的活化产生。

2.2 NFAT 活化T 细胞核因子(Nuclear factor of activated T cells，NFAT)家族(NFAT1-5)被广泛地发现于各种免疫细胞和组织中，调控许多炎症介质的表达。NFAT 由胞浆中钙离子的升高激活。细胞内钙离子的增加激活钙调蛋白，从而激活丝氨酸/苏氨酸磷酸酶、钙神经素。钙神经素使NFAT 去磷酸化，暴露核输入序列，允许转录因子易位入细胞核，促进基因转录［13］。一些研究小组已经证明NFAT 由P2X7 受体调控，因此，核酸引起的此转录因子家族的活化可能是P2X7 受体调控免疫调节因子表达的一个重要机制。Yip 等［14］表明Jurkat T 细胞中的P2X7RNAi 减弱NFAT 的活化和由T 细胞活化因子诱导的IL-2 的转录。Adinolfi 等证明P2X 抑制剂(Ox-ATP)减少外源性表达P2X7 受体的HEK293 细胞上的NFAT1 的核表达。Kataoka 等［15］表明ATP激活MG-5 神经胶质细胞上NFAT1 的表达。Ferrari等［16］报道BzATP和ATP激活N9胶质细胞的NFAT。

2.3 NF-κB 核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是一种具有基因转录多项调控作用的转录因子，能与多种细胞基因启动子或增强子序列特定位点发生特异性结合而促进转录和表达，与炎症反应、免疫应答以及细胞的增生、转化和凋亡等重要的病理生理过程密切相关。NF-κB 通过与抑制剂κB(IκB)的结合以未活化状态存在于胞浆中［17］。IκB被IκB 激酶(IKK)磷酸化后，NF-κB 进入核中，促进基因转录。NF-κB 调控大量的免疫调节基因的诱导，包括IL-6、IL-8、TNF-a、iNOS 和COX-2［18，19］。已有报道发现P2X7 激动剂刺激NF-κB 的易位和DNA结合。Ferrari 等表明ATP 能刺激鼠胶质细胞系N9和N13 上NF-κB 结合到DNA，抗氧处理能抑制这种结合。Budagian［20］等报道ATP 能刺激Jurkat T 细胞中NF-κB 与DNA 结合。Korcok［21］等证明BzATP 能诱导鼠破骨细胞中NF-κB 的核易位，但是P2X7 被敲除的小鼠的破骨细胞不能被诱导。BzATP 诱导鼠RAW 264.7 巨噬细胞和人外周血单个核细胞中NFκB 和DNA 结合［22］。

2.4 CREB cAMP 应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)作为细胞核内调控因子，通过自身磷酸化实现调节功能，从而调控细胞周期［23，24］。亮氨酸拉链转录因子在控制许多细胞生理过程中起作用，包括糖内稳态，细胞生存和炎症介质产生。丝氨酸133 上CREB 的磷酸化通过CREB 结合蛋白(CBP)或者p300 刺激共活化，允许CREB 与cAMP 反应性基因的启动子上的保守的CREB 反应元素(CREs;5'-TGACGTCA-3')结合。在一些免疫调节基因如IL-2、IL-6、IL-10 和TNF-a 的启动子里含有CREB 位点［25］。P2X7 的活化能够引起单核细胞上CREB 激活，用P2X7 激动剂BzATP刺激细胞后会导致依赖于ERK1/2 和钙离子的丝氨酸133 位的CREB 磷酸化［4］。P2X7 配体会导致人外周血单个核细胞、人单核细胞株THP1、鼠巨噬细胞株RAW264.7 和外源性表达P2X7 受体的HEK293 细胞上的CREB 活化。P2X7 功能缺失的RAW264.7 突变株、RAWS324F 细胞在BzATP 刺激后并不表现出CREB 磷酸化，但是LPS 或anisomycin(p38MAPK 的激动剂)刺激后会导致CREB 活化。Potucek［26］等报道BzATP 能够激活BV-2 胶质细胞的CREB。用CREB 阴性构建体抑制CREB 的活化后，AP-1 基因c-Fos 和FosB 的表达明显减弱，这进一步支持P2X7 在基因表达转录调控中起作用［3，4］。

2.5 AP-1 AP-1(Activating protein 1)是一类由立即早期基因编码的核转录因子，能被紫外光、生长因子和氧化应激等许多因素激活，调控对转移、侵蚀、分化、缺氧、血管发生、增殖和凋亡有重要作用的基因的转录［27-29］。这个转录因子家族包括c-Jun、JunB、JunD、Fra-1、Fra-2、c-Fos、FosB、ΔfosB 以及与基因启动子中AP-1 位点结合的由它们形成的二聚体［17，30］。AP-1 家族成员含有一个基本的亮氨酸拉链区，此区域对该成员与其他的AP-1 成员二聚化以及与DNA 结合有重要作用。具有转录活性的AP-1蛋白由一个Jun 蛋白和一个Fos 家族成员组成。正常条件下，AP-1 蛋白的浓度和活性极低，分子构成以Jun 同源二聚体为主。细胞受到刺激时，AP-l 蛋白水平短暂而迅速地升高，并转变为以c-Fos、c-Jun异源二聚体为主要存在形式，DNA 连接和诱导转录的能力也随之迅速升高;以后随着半衰期较短的c-Fos 的降解，AP-1 又恢复至基础水平和惰性状态。我们和其他研究组均发现P2X7 配体能够诱导AP-1转录因子的表达和活化［3］。P2X7 配体能够较弱地诱导c-Fos 和FosB 的表达，但是能强烈的促进巨噬细胞和成骨细胞中FosB 和ΔFosB 的产生［3］，这些激动剂刺激FosB 蛋白与DNA 的结合。FosB 和ΔFosB 是2 个研究最少的AP-1 家族成员，但是越来越多的研究支持它们在炎症、骨更新和神经功能中充当转录因子的角色。

3 ATP/P2X7/FosB 路径

FosB 和ΔFosB 由一个PEST 区(富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸的序列)、一个基本区和一个亮氨酸拉链组成。亮氨酸拉链是FosB 和Jun 相互作用的主要位点［31］。ΔFosB 是FosB 被截短后的接合突变体，是全长的FosB 的转录激活区域中的一部分，与FosB 相比，其C 端缺少101 个氨基酸。ΔFosB 被假设为药物成瘾发展过程中的一个“分子闸门”，对正常精神行为的维持至关重要。FosB 和ΔFosB 还具有许多功能，包括调控炎症反应和骨形成的能力。

ATP/P2X7/FosB 路径以前未被发现，现在我们发现其存在于单核细胞和成骨细胞中，参与多个免疫调控因子的转录调节。P2X7 配体(BzATP、ATP)瞬间刺激后会诱导外周血单核细胞、RAW264.7 巨噬细胞、鼠骨髓衍生的巨噬细胞、前成骨细胞系MC3T3-E1 和稳定表达P2X7 的HEK293 细胞中FosB 和ΔFosB 的表达［3］。为了进一步证实P2X7介导FosB 和ΔFosB 的产生，使用最近研发的P2X7抑制剂进行对照试验，发现P2X7 S342F 突变(会导致P2X7 功能缺失)的RAW 264.7 细胞上BzATP 介导的FosB 和ΔFosB 的产生明显减少。BzATP 不能诱导P2X7 缺陷的细胞株的FosB 与DNA 结合。P2X7 拮抗剂A438079 使RAW 264.7 巨噬细胞上BzATP 诱导的FosB 和ΔFosB 的产生减弱。这些说明P2X7 在核酸刺激后引起FosB 和ΔFosB 的表达。引人注意的是，低水平的BzATP(5～30 μmol/L)不能激活P2X7 介导的大多数细胞通路，例如离子通道活化和孔道形成，但是能够诱导FosB 和ΔFosB 的表达［3］，表明FosB 和ΔFosB 是反映P2X7 活动最敏感的两个介质。BzATP 处理细胞1 h 后FosB 和ΔFosB 均表达，FosB 持续至少3 h，但是BzATP 处理RAW264.7 细胞8 h 后FosB 和ΔFosB 大幅度降解，这与大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)中在用20%血清处理后8 h 内FosB 和ΔFosB 降解这一结果一致［32］。

4 结语

核酸受体P2X7 是炎症反应的一个重要调节物，大量的研究支持P2X7 是炎症时的一个有意义的治疗靶点，P2X7 拮抗剂的研发将给临床上炎症性疾病如类风湿性关节炎的治疗带来希望。最近大量报道支持P2X7 诱导免疫调节基因的转录，为P2X7控制多个生理病理反应的机制提供新观点。P2X7的生物学研究领域正在迅速地扩大，此受体与免疫调控、骨形成和神经功能有关的许多机制还有待研究。

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