猪星状病毒的病原学特征及检测技术研究进展

(山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

猪星状病毒的病原学特征及检测技术研究进展

庄金秋，梅建国，姚春阳，王 艳，李 峰

(山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

猪星状病毒（PAstV）是一种严重危害哺乳期仔猪的人兽共患病病原，给养猪业带来了较大的经济损失。通过对PAstV的病原学特征及检测技术研究进展作一简要概述，为科研人员加强对其的深入研究及了解仔猪病毒性腹泻疫情的整体概况提供参考。

猪星状病毒；病原学；检测；研究进展

猪星状病毒（PAstV）为星状病毒科成员。星状病毒（AstV）是一类广泛存在于人和多种哺乳动物及鸟类的人兽共患病病原，广泛分布于世界各地。AstV目前已经从人、猪、牛、犬、水貂等31种哺乳类动物和鸡、火鸡、鸭和鸽子等6种禽类中检出，而且其宿主范围仍呈现出不断扩大的趋势[1]。PAstV对哺乳期仔猪侵害较大，常引起腹泻、脱水和呕吐等临床症状，导致乳猪生长迟缓，严重者可引起死亡，给养猪业带来一定的经济损失。目前，本病尚无治疗药物和预防疫苗。本文就PAstV的由来和发现、病毒的分类地位、流行病学及检测方法等研究现状作一简要概述，以期为疾病的有效防控提供参考。

1  病毒的由来和发现

AstV首次于1975年由Appleton和Higgins[2]用电镜检测胃肠炎患儿粪便标本时发现，由于电镜下病毒粒子呈星形，因此被Madeley和Cosgrove命名为星状病毒[3]。PAstV首次由Bridger通过电镜在3周龄的乳猪腹泻粪样中观察到，随后日本、南非、捷克、哥伦比亚、匈牙利、加拿大、美国及中国等国家均有从猪腹泻粪样中检测到PAstV的报道。Shimizu等报道PAstV在猪群中普遍存在，而且常同冠状病毒、嵌杯状病毒、轮状病毒及其他肠道病毒混合感染造成猪急性胃肠炎。有学者认为PAstV是引起近年来仔猪病毒性腹泻疫情的主要病原之一。

2  病毒的分类地位

星状病毒科分为哺乳动物星状病毒属和禽星状病毒属。PAstV属于哺乳动物星状病毒属，还包括人星状病毒、牛星状病毒、猫星状病毒和绵羊星状病毒等，该属以人星状病毒作为代表种。禽星状病毒属包括鸭星状病毒，火鸡星状病毒和禽肾炎病毒，以火鸡星状病毒为代表种[4]。

3  病毒的病原学特征

3.1 病毒的形态及理化特性

PAstV为无囊膜的单股线状RNA病毒[5]，Shimizu等（1990）观察到病毒粒子呈球形，直径约30 nm，有许多粒子呈六角或五角的星样结构，同时还观察到一些空壳粒子。PAstV对氯仿和乙醚等有机溶剂、高浓度的盐、表面活性剂（1%SDS）、胰蛋白酶及两性离子消毒剂等稳定，但不耐受3M尿素的处理（37 ℃，30 min）。病毒对酸（pH3.0）稍微不稳定，对热处理稳定，能抵抗50 ℃1 h，60 ℃5 min[6]。

3.2 病毒的基因组结构及功能

PAstV只有一个结构蛋白，即衣壳蛋白。兰家暖等[7]在国内首次从猪腹泻粪样中扩增出PAstV衣壳蛋白ORF2基因。刘欢[8]通过采用PCR及RACE技术，基本实现了分离病毒PAstV-GXl扩增的全基因组序列，所获得全长为6 342 bp，基因组包含大部分ORFla、完整的0RF2、ORFlb、3'非编码区及poly（A）。PAstV目前发现5个差异显著的基因型（PAstVl-PAstV5）。不同地区存在不同的流行毒株，我国的流行毒株为PAstV1型。

3.3 病毒的培养特性

与其他肠道病毒相似，PAstV在体外培养时，需要在培养液中额外添加胰酶。Lee等发现PAstV在没有胰酶存在的条件下，即使延长病毒的吸附时间也很难实现在细胞中的感染。刘欢（2014）研究发现，在添加胰酶时，病毒的感染性通过观察细胞病变（CPE）就可以发现明显高于不添加胰酶的病毒。

4  病毒的致病性

目前PAstV引起腹泻的机制仍不完全清楚，可能是病毒侵入机体后，破坏小肠黏膜及绒毛上皮细胞，使肠吸收功能受损，分泌增加；也可能是引起小肠上皮细胞屏障通透性增加，最终导致渗透性腹泻。Bridger报道，用含有PAstV、嵌杯状病毒、非典型轮状病毒和肠道病毒的粪便过滤液接种新生仔猪后出现厌食、腹泻和生长受阻，最后死亡。但这种接种方法不能代表PAstV的致病性。Shimizu等用克隆化的PAstV接种4日龄的仔猪后出现温和性腹泻，并且在粪便中能检测到PAstV。PAstV有感染人类或其他物种的可能性，隐性感染猪可作为PAstV的储存宿主及持续传染源而感染人或其他动物。Jonassen等研究发现人、猫星状病毒和PAstV遗传距离最相近，提示星状病毒在进化过程中存在种间交叉传播，有可能是猪传给猫或猫再传给人以及可通过中间宿主进行传播。Ulloa等发现，来自住在同一栋房子的人及猪腹泻样品中人星状病毒和PAstV部分基因出现重组，认为星状病毒可能存在种间交叉传播。

5 病毒的流行病学特点

PAstV自然感染多发生于1日龄至8周龄的仔猪。患猪腹泻，呈糊状乃至黄色水泻。PAstV感染主要发生于天气寒冷及气温多变的冬春季节，具有一定的流行性。兰加暖等通过检测带有腹泻症状的猪群粪便，发现PAstV的流行率为40.3%，猪场阳性率更是高达80%以上。综合国内外PAstV流行病学调查资料，可知PAstV的流行率在0%～83%之间。

6  病毒检测技术研究进展

6.1 电镜检查

直接电镜检查在星状病毒感染的早期研究中发挥了重要的作用。Appleton等（1975）首次用电镜发现了星状病毒。将粪便样本用蒸馏水稀释成20%悬液，离心后取上清液，用1%磷钨酸钾液（pH7.0）染色后，电镜检查。如果粪便中有星状病毒存在，根据其特有的星状结构、28～30 nm直径等特征较易检出。该法价格昂贵，技术条件要求高，不适合大规模的流行病学调查。

6.2 病毒的分离培养

由于星状病毒在细胞培养物中的培养比较困难，而且多数星状病毒在细胞培养物中不产生CPE，给病毒分离工作带来了难度。Lee等研究发现在添加胰酶的条件下，人星状病毒可在人胚胎肾细胞（HEK）、恒河猴肾细胞（LLC-MK2）及原代狒狒肾细胞中增殖。Shimizu等用猪胚肾建立的细胞系首次从患急性胃肠炎的猪中分离到一株能引起CPE的PAstV，该病毒引起的CPE特征表现在能使细胞增大和在胞浆中有细小颗粒出现。Willcocks等采用传代细胞系人类结肠癌细胞直接从粪便标本中分离星状病毒并获得成功，而无需先在HEK细胞中进行传代。近年来，国内外也有关于利用PK-15细胞系成功分离PAstV的报道。商晓桂[9]通过对上海郊区某猪场疑似PAstV感染猪的粪样进行病毒分离和纯化，获得一株能在PK-15细胞上增长繁殖，并使该细胞产生破碎、脱落等CPE的病毒。兰家暖等[10]用PK-15细胞从PAstV广西流行株中分离到2株具有CPE和致病性的PAstV。刘欢（2014）首次使用TPCK处理过的胰酶，成功实现了PAstV在PK-15中的稳定增殖。对细胞培养物中分离到的病毒，可用电镜及免疫荧光试验等方法进行鉴定。

6.3 血清学检测技术

星状病毒在培养细胞内的大量增殖，可用于制备不同血清型的单克隆和多克隆抗体，从而促进了星状病毒免疫学检测方法（如ELISA、免疫荧光等）的发展。ELISA的优点是抗原抗体均可检测，便利、快速、特异性强，并可用于分型研究，缺点是敏感性略低于电镜，且无法分辨是野毒感染还是疫苗免疫结果。免疫荧光试验主要用于对细胞培养物或组织切片中星状病毒的检测，还可检测病毒在细胞中的增殖特性和规律，但被检病料来源有一定的局限性，用于死亡动物的检测。目前国内外尚没有商品化的PAstV血清学检测试剂盒。

6.4 分子生物学检测技术

RT-PCR在检测星状病毒方面，比ELISA具有更高的灵敏性及特异性，已成为临床上检测星状病毒最主要的手段。商晓桂应用PK15细胞从上海某疑似PAstV感染猪场分离到的PAstV，经RT-PCR检测到PAstV目的条带，表明该猪场患病猪为星状病毒感染。兰家暖等采用套式RT-PCR技术，对2008—2010年从广西7个市县29个不同规模化猪场采集的315份不同阶段猪腹泻粪样进行PAstV分子流行病学调查及基因型分析，表明PAstV在广西地区猪群中已普遍存在。商晓桂等[11]建立了检测PAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法，其方法灵敏度可达10个拷贝，是普通RT-PCR的100倍，特异性和重复性较好，可用于PAstV的检测，这为PAstV感染的调查及诊断提供了重要的技术支持。

7  小结

PAstV在猪群中普遍存在，而且常与其他肠道病毒混合感染导致仔猪腹泻，每年都会给养猪业造成较大的经济损失。随着分子生物学技术的发展和对PAstV研究的逐步深入，人们逐步认识到PAstV的感染率和发病率均高出预期[12]。虽然PAstV致病机制还有待于进一步的体内和体外研究，但星状病毒的多宿主性、基因差异性及其重组现象和跨种间传播及适应新宿主的能力，使得星状病毒成为潜在的新兴人畜共患病原并具有重要的公共卫生意义。

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[3] 朱爱玲.犬星状病毒（Canineastrovirus，CaAstv）半巢式RT-PCR检测方法的建立及基因序列分析[D].上海：上海交通大学， 2012：1-10.

[4] 郭翠平.鸭星状病毒1型WF1202株全基因组序列的测定与单因子血清的制备[D].泰安：山东农业大学，2014：1-5.

[5] 艾佛德.广西牛星状病毒分子流行病学调查与全基因克隆及序列分析[D].南宁：广西大学，2014：1-3.

[6] 兰家暖.猪星状病毒分离鉴定和分子流行病学调查及生物学特性研究[D].南宁：广西大学，2011：1-10.

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[8] 刘欢.猪星状病毒分离鉴定及其全基因组序列分析和衣壳蛋白原核表达[D].南宁 广西大学，2014：79.

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[10] 兰家暖，郭旋，刘磊，等. 猪星状病毒的分离鉴定及其致病性研究[J].中国畜牧兽医，2012，39（7）：199-203.

[11] 商晓桂，郭伟，杨莲茹，等. 猪星状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用[J]. 畜牧兽医学报，2010，41（8）：1049-1053.

[12] 杨文宇，周远成，韩燕，等. 猪A群轮状病毒和C群轮状病毒以及猪星状病毒多重RT-PCR同时检测方法的建立及应用[J]. 中国兽医科学，2014，44（4）：394-400.

2015-05-15）

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-06-022-15）

庄金秋（1978-），女，兽医硕士，副研究员，主要从事细胞培养和动物用病毒疫苗研制。