犬布鲁氏菌病实验室诊断方法研究进展

董春霞何 琴

（1.重庆市动物疫病预防控制中心,重庆 401120；2.重庆市巴南区动物疫病预防控制中心,重庆 401320）

犬布鲁氏菌病实验室诊断方法研究进展

董春霞1何 琴2

（1.重庆市动物疫病预防控制中心,重庆 401120；2.重庆市巴南区动物疫病预防控制中心,重庆 401320）

布鲁氏菌病（Brucellosis）又称地中海弛张热，马耳他热，波浪热或波状热，是由布鲁氏菌引起的人畜共患传染病。以流产、不育、生殖器官和胎膜发炎为特征，人感染后可引起波浪热为特征。自1887年（Bruce）首次从因布鲁氏菌病死亡士兵脾中分到布氏菌迄今已百余年。据20世纪80年代末的报告，在世界200多个国家和地区中已有160多个存在人畜布鲁氏菌病，分布于世界各大洲。该病在我国的内蒙古、东北、西北等牧区曾一度流行，北方地区也有散发，由于布鲁氏菌病对畜牧生产影响很大，造成了很大的损失，我国政府长期致力于牛、羊、猪等的布鲁氏菌病预防和控制工作，但却忽视了犬布鲁氏菌病的防控、监测和诊断治疗。随着人们生活水平的不断提高，宠物犬的饲养数量也急剧增加，人与犬共眠同枕的现象也屡见不鲜，犬作为人类布鲁氏菌病的重要传染源之一不容忽视。单从临床上来诊断布鲁氏菌病是比较困难的，往往需要采用实验室诊断技术才能对其确诊，现阶段犬布鲁氏菌病实验室技术方法研究进展做一综述。

1 细菌学诊断方法

1.1 涂片检查

将流产胎儿的胃内容物、肺、肝和脾，以及流产胎盘和羊水等标本直接涂片，柯兹洛夫斯基鉴别染色可做出初步的疑似诊断，细菌呈红色球状小杆菌。

1.2 分离培养

对于疑似布鲁氏菌感染的动物，做血液细菌分离培养是最具诊断性的检测方法。培养后，按常规方法进行鉴定，也可用PCR方法、定量PCR方法鉴定。虽然细菌分离作为布鲁氏菌病诊断的金标准，但是这种诊断方法烦琐、培养鉴定时间长、试验条件要求高，只能在具备相应生物安全级别的实验室进行，受实验室条件限制很难进行。

2 血清学诊断方法

2.1 凝集试验

快速平板凝集实验（RSAT）是一种快速的检测方法，具有特异、敏感、廉价、操作简便的特点，但受验温度和凝集时间相对较短的影响，不易准确判定结果，所以，本方法主要作为布鲁氏菌病监测的初筛试验。对RBPT阳性样品还需要通过试管凝集试验（SAT）或补体结合试验（CFT）进行最终的判定。SAT是中国法定布鲁氏菌病诊断的正式试验，可作为布鲁氏菌病的早期诊断，同时，用于人畜布鲁氏菌菌苗免疫后血清抗体的检测，但不适合绵羊种布鲁氏菌病的诊断。具有结果判断容易的优点，但操作繁杂、费时，不适于现场应用。因为特异性和敏感性都比较差，在发达国家基本上已经停止使用了。

2.2 补体结合试验（CFT）

补体结合试验是目前血清学试验中最为准确的试验技术之一，被世界动物卫生组织认证为布鲁氏菌病诊断的确诊性试验。由于猪的补体会干扰豚鼠补体的作用，导致试验的敏感性降低38%～40%，因而CFT不适合猪种布鲁氏菌病的检测。CFT参与的成分多，需要设立各种各样的对照组，试验步骤多，结论也具有主观性，对操作者的要求比较高，不适宜在基层推广以及进行现场检测。CFT在进行结果判定时，主要是采用目视比色法来比较有色溶液颜色的深浅来测定溶血程度，所以，试验结果很容易受主观因素的影响而导致一定的误差。

2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA 是免疫技术中应用最广的一种，在适合的载体上，酶标记抗体或抗原与相应的抗原或抗体形成酶标记的抗原-抗体免疫复合物，在一定的底物参与下，复合物上的酶催化底物，使其水解、氧化或还原成另外一种带色物质。由于在一定条件下，酶的降解底物和呈现色泽是成正比的，因此，可以应用酶测定仪进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的种类和含量。ELISA方法具有敏感、特异、简单、快速、稳定、安全及污染少、易于自动化操作等特点。既可以作为确定检测，又可以作为筛选和鉴别用，但由于试验条件要求高，操作较烦琐，不宜用作快速诊断，也不宜向基层推广以及进行现场检测。

2.4 胶体金免疫层析检测技术（GICA）

Kim等[13]用犬种布鲁氏菌的抽提物作为检测抗原建立了检测犬血清布鲁氏菌病抗体的GICA。分别用血液培养、2-巯基乙醇快速筛选凝集试验（2-MERSAT）和GICA对发生布鲁氏菌病的10个不同圈舍的犬群进行检测，阳性率分别为24.8%、39.5%和39.1%。结果表明，GICA与常规的凝集试验和细菌学检测具有同样的敏感性和特异性。GICA诊断布鲁氏菌病，不仅具有试剂敏感、特异，且血清用量少，操作简便快速，适合于布鲁氏菌病的诊断、流行病学调查及现场检测。

3 分子生物学诊断方法

3.1 PCR法

随着分子生物学技术的发展，PCR技术成为布鲁氏菌病分子生物学检测和病原分种、分型的重要手段，也是当今研究的热点。钟旗等以布鲁氏菌病致病力因子－四型分泌系统中的VirB8基因为模板，设计引物，建立VirB8-PCR方法。通过特异性和敏感性试验，结果表明本检测方法的特异性为100%，Hinic等建立的既可常规操作又可resl-time PCR的PCR新方法特异性强，可鉴别6个种的布鲁氏菌。

3.2 环介导等温扩增法

Ohtsuki等根据流产布鲁氏菌BCSP31株的基因序列设计两组用于6个种布鲁氏菌鉴别的环介导等温扩增（LAMP）的特异性引物，通过对6个种22株布鲁氏菌和18个种28株非布鲁氏菌的检测表明，对布鲁氏菌的检测具有特异性（5min，63℃）和敏感性（10fg基因组DNA）。

4 讨论

除了上述检测方法外，滴金免疫测定法（DIGFA）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、免疫组化法（immunochemistry）、荧光探针分析法（fluorescence polarization assay FPA）等方法与技术也在布鲁氏菌病检测中发挥重要作用，各种方法各有优缺点。快速、精确的诊断布鲁氏菌病是有效防控本病的基础和必要条件，各国布鲁氏菌病诊断技术的不断研究、发展为快速、精确的诊断本病提供了必要的技术支持。由于犬饲养数量的增多以及与人类的密切接触，使得犬布鲁氏病将成为未来人类感染布鲁氏菌病的传播方式之一。我国对犬布鲁氏菌病的分布、流行情况还不是十分了解，疫苗研究几乎为零，这样既不利于犬的繁殖和饲养，也影响了人类和家畜布鲁氏菌病的防控。因此，加大投入力度，广泛开展犬布鲁氏菌病流行病学调查，研究简便快速、高通量的监测技术，研制适合犬应用的疫苗，对于犬、家畜和人类布鲁氏菌病的防控均具有重要的意义。