MGMT基因甲基化水平与恶性胶质瘤细胞对烷化剂耐药性的相关性

MGMT基因甲基化水平与恶性胶质瘤细胞对烷化剂耐药性的相关性

杨洁袁江伟王玉祥宋玉芝李娟张辛杨琼

(河北医科大学第四医院放疗五病区，河北石家庄050000)

摘要〔〕目的探讨DNA修复蛋白6-O-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因甲基化状态与恶性胶质瘤细胞对烷化剂抗肿瘤药物耐药性的相关性。方法选择36例经手术后病理学检查确诊的恶性胶质瘤患者作为研究组，选取同期脑卒中患者10例作为对照组，比较两组患者术前、术后脑组织中的MGMT蛋白表达水平、MGMT甲基化状态差异，并分析MGMT甲基化与治疗效果的关系。结果研究组的MGMT蛋白表达阳性率显著高于对照组，去甲基化水平显著高于对照组(P<0.05)。有效组16例患者，无效组20例患者，有效组MGMT蛋白表达阳性率显著低于无效组，甲基化水平显著高于无效组(P<0.05)。Ⅲ级患者17例，Ⅳ级19例，两种不同病理分级患者的MGMT蛋白、MGMT启动子基因表达率上无差异(P>0.05)。MGMT蛋白表达阳性的20例患者中仅有3例甲基化表达(15%)，MGMT蛋白表达阴性的16例患者中有14例甲基化表达(87.5%)，MGMT蛋白表达与MGMT启动子基因甲基化状态具有关联性(χ2=18.747，P=0.000)。结论MGMT蛋白表达与MGMT启动子基因甲基化状态呈负相关性，MGMT基因去甲基化状态会增加恶性胶质瘤细胞的耐药性。

关键词〔〕DNA修复蛋白6-O-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因；甲基化状态；恶性胶质瘤

中图分类号〔〕R39〔文献标识码〕A〔

基金项目：河北省卫生厅青年科技课题(No.20130245)

通讯作者：王玉祥(1969-),男，主任医师，博士，主要从事恶性胶质瘤、食管癌、肺癌等的临床与基础研究。

第一作者：杨洁(1982-)，女，硕士，主要从事恶性胶质瘤的基础及临床研究。

烷化剂化疗在脑胶质瘤的综合治疗中占有重要地位〔1〕。烷化剂主要通过攻击人体细胞内的DNA，造成DNA碱基的烷基化损伤，进而形成DNA交联，从而导致细胞死亡〔2〕。DNA修复蛋白6-O-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)作为一种细胞中普遍存在的DNA修复酶，是目前为止发现的唯一可以将6-O-鸟嘌呤复合物从DNA上移除的蛋白质，可以保护染色体免受烷化剂导致的突变、细胞毒以及致癌作用〔3〕。本研究探讨MGMT基因甲基化状态与恶性胶质瘤细胞对烷化剂抗肿瘤药物耐药性的相关性。

1资料与方法

1.1一般资料本研究选取我院肿瘤科2009年1月至2012年8月收治的36例经手术后病理学检查确诊的恶性胶质瘤患者及同期脑卒中患者10例。纳入标准：恶性胶质瘤患者均为首次入院治疗、经过手术后组织学病理检查确诊的患者(WHO分级Ⅲ、Ⅳ级)、手术前未经过放疗和化疗治疗、术前KPS评分>60分；脑卒中患者经过CT或MRI证实、并经过手术治疗、不合并肿瘤。排除标准：合并身体其他部位肿瘤的患者，术前接受过放化疗治疗的患者。本研究共纳入46例患者，研究组36例，男21例，女15例，年龄62～73〔平均(67.4±9.8)〕岁；对照组10例，男6例，女4例，年龄63～74〔平均(65.3±10.4)〕岁。两组患者年龄、性别无差异(P>0.05)。

1.2治疗方案患者均口服替莫唑胺(TMZ)，起始剂量为：每天150 mg/m2，共计5 d，停药23 d，第1周期的治疗时间为28 d。从第2周期开始，根据第1周期患者出现的不良反应适当调整剂量，最大可增至每天200 mg/m2，或者降至100 mg/m2。在放疗过程中密切观察患者状态，若出现脑水肿等不良反应，应及时使用20%的甘露醇加激素等脱水、利尿、降颅压。每周对患者进行血常规检测，并定期复查肝肾功能，根据检查的结果及时应用升血小板、白细胞或者保肝药物。

1.3主要仪器与试剂PCR仪(美国PTC-100型PCR仪)；凝胶电泳(北京六一仪器厂)；SP广谱试剂盒北京中山金桥生物公司；伊红染液(台湾BASO贝索企业)；DNA纯化试剂盒(上海生工生物工程公司)；浓缩型鼠抗MGMT单克隆抗体(北京中山金桥生物公司)。

1.4免疫组化法测定肿瘤组织MGMT蛋白对患者的肿瘤组织进行HE染色后免疫组化，组织蜡块以4 μm的厚度进行连续切片后，置于60℃的烤箱进行干燥40 min；常规脱蜡至水；在3%的过氧化氢溶液室中孵育10 min，以阻断内源性过氧化氢的活性，滴加一抗，并在4℃的抗湿盒于冰箱中过夜；滴加聚合物增强剂，并在室温下孵育20 min；滴加酶标抗鼠聚合物，室温下孵育30 min；PBS(pH7.4)冲洗3 min，冲洗3次；将PBS去除，滴加刚配制的DAB溶液，显微镜下观察。

1.5血清MGMT基因启动子甲基化状态测定首先制备患者外周血循环DNA并将其纯化，具体纯化方法参照罗敏捷的研究，并加以改进〔4〕。对患者的外周血循环DNA进行甲基化处理，并进行引物序列设计，对甲基特异性PCR进行扩增，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行扩增产物的鉴定。

1.6结果判定MGMT蛋白阳性染色主要定位于胞质及细胞核，染色为粉红色。无任何染色(-)、着色极弱且难以判断或阳性细胞≤10%者为(±)、有>10%且≤30%的着色阳性细胞(+)、有>30%的着色阳性细胞()。MGMT甲基化结果判定：MGMT-M(甲基化)或MGMT-U(非甲基化)如扩增出一条83 bp的带者为阳性，MGMT-M阳性+MGMT-U阴性即为完全甲基化。MGMT-M阴性+MGMT-U阳性即为非甲基化。术后化疗6个月疗效判定：依据1979年世界卫生组织实体瘤疗效评价标准，根据CT和MRI检查结果：分为完全缓解(CR)：所有肿瘤病灶完全消失且持续4 w以上；部分缓解(PR):肿瘤病灶体积缩小≥50%；稳定(SD):肿瘤病灶体积增加<25%或缩小<50%；进展(PD): 肿瘤病灶体积增加≥25%或有新的肿瘤病灶出现。总有效例数=完全缓解+部分缓解。

1.7统计学方法采用SPSS10.0进行t及χ2检验。

2结果

2.1两组MGMT表达及甲基化情况研究组的MGMT蛋白表达阳性率〔91.67%(33/36)〕显著高于对照组〔10%(1/10)〕，去甲基化水平研究组〔94.44%(34/36)〕显著高于对照组〔10%(1/10)，χ2=27.070,30.672,P<0.05〕。

2.2恶性胶质瘤患者化疗6个月后不同疗效患者的MGMT表达及甲基化情况有效组16例患者，无效组20例患者，有效组MGMT蛋白表达阳性率显著低于无效组〔12.50%(2/16) vs 90%(18/20)〕，甲基化水平显著高于无效组〔81.25%(13/16) vs 10%(2/20),χ2=21.623,18.566,P<0.05〕。

2.3不同病理分级患者的MGMT表达及甲基化情况Ⅲ级患者17例，Ⅳ级19例，Ⅲ级与Ⅳ级患者的MGMT蛋白阳性率、MGMT启动子基因甲基化〔35.29%(6/17) vs 47.37%(9/19),χ2=0.071,P=0.530〕差异均不具有统计学意义(P>0.05)。

2.4MGMT蛋白表达与MGMT启动子基因甲基化的相关性MGMT蛋白表达阳性的20例患者中仅有3例甲基化表达(15%)，MGMT蛋白表达阴性的16例患者中有14例甲基化表达(87.5%)，MGMT蛋白表达与MGMT启动子基因甲基化状态具有关联性(χ2=18.747，P=0.000<0.001)。

我们应注意到季札是将《唐风》和尧联系起来考虑的。 他说：“思深哉！其有陶唐氏之遗民乎？不然，何忧之远也？非令德之后，谁能若是？”也就是说，晋国处于尧之故地，故有尧之遗风。 若其不是故尧之遗民，则不会如此忧思之远，不会有如此之深虑。 这又不得不对尧文化进行考察。

3讨论

烷化剂药物杀伤肿瘤细胞的机制现已经非常明确，主要通过攻击人体细胞内的DNA，造成DNA碱基的烷基化损伤，进而形成DNA交联，从而导致细胞死亡。MGMT为一种全长为769 bp的cDNA，可以保护染色体免受烷化剂导致的突变、细胞毒以及致癌作用。在肿瘤细胞中，MGMT分子上的2个烷基受体可以接受烷基化损伤的DNA烷基，从而修复被烷基化损伤的鸟嘌呤，阻止DNA的交联以降低烷化剂药物的细胞毒性作用〔5〕。但值得注意的是，MGMT只能够修复被烷化剂药物损伤的烷基化鸟嘌呤，但对已经交联的DNA却没有作用〔6〕。

脑胶质瘤具有多种不同的病理类型，而MGMT对其化疗效果的影响也不同。对于多形性胶质母细胞瘤，卡莫司汀对于MGMT阳性的病人比MGMT阴性的病人化疗效果差。但对于间变性星型细胞瘤，化疗效果与MGMT表达关系并不密切〔7〕。MGMT基因启动子甲基化的发生率就越低，肿瘤的恶性程度就越高〔8〕。在治疗方面，在化疗基础上加用TMZ进行治疗可以明显改善恶性胶质瘤患者的生存率(2年生存率为46%)，从而建立了一种恶性胶质瘤新的治疗标准〔9〕。MGMT基因作为一种可以识别恶性胶质瘤的临床相关性分子标记物，其基因沉默与TMZ的治疗效果具有相关性〔10〕。在与肿瘤细胞耐药性的关系研究方面，MGMT酶蛋白、酶活性以及MGMT mRNA的高低决定了肿瘤细胞对烷化剂的耐药程度，即MGMT活性越高的细胞对烷化剂的耐药性就越强，因此，如果能够降低肿瘤细胞内的MGMT蛋白水平或者酶活性就很有可能克服肿瘤细胞对于烷化剂的耐药性。

肿瘤组织中的MGMT基因启动因子与其血清中的含量具有显著一致性，在检测胶质母细胞瘤以及非小细胞型肺癌患者的肿瘤组织以及血清中的MGMT基因甲基化水平可以发现，血清中的MGMT基因启动因子甲基化与肿瘤组织具有显著的相关性〔6〕。因此，通过检测胶质瘤患者血清中的MGMT基因启动因子甲基化可以用于制定个体化的化疗方案以及预测患者的预后。而本研究结果与上述研究结果相似，说明胶质瘤患者血清中的MGMT蛋白表达高于其他非肿瘤性疾病，可以用于辅助临床诊断。本研究显示MGMT蛋白可以在不同类型胶质瘤的表达上有差异，但在不同分期胶质瘤的区分上还不够灵敏，MGMT蛋白表达与MGMT启动子基因甲基化状态具有关联性。

综上，MGMT蛋白表达与MGMT启动子基因甲基化状态呈负相关性，但与病理分型无关，MGMT基因去甲基化状态会增加恶性胶质瘤细胞的耐药性，因此对于没有通过手术获得病理诊断的患者，测定其血清MGMT蛋白与MGMT启动子基因甲基化情况可以指导临床进行个性化化疗方案的选择。

参考文献4

1王茂德，李瑞春.脑胶质瘤显微手术的功能区定位意义和临床研究进展〔J〕.中华临床医师杂志(电子版)，2013；33(22)：9828-31.

2罗敏捷，张旺明，王军，等.恶性脑胶质瘤MGMT基因启动子甲基化状态与患者临床预后的相关性〔J〕.中华神经医学杂志，2012；11(6)：565-9.

3Kitange GJ，Mladek AC，Brett L，etal.Inhibition of histone deacetylation potentiates the evolution of acquired temozolomide resistance linked to MGMT upregulation in glioblastoma xenografts〔J〕.Clin Cancer Res，2012；18(15):4070-9.

4罗敏捷.恶性胶质瘤组织MGMT基因启动子甲基化状态及蛋白表达与患者临床预后的相关性研究〔D〕.广州：南方医科大学硕士学位论文，2012.

5Koutsimpelas D，Pongsapich W，Heinrich U，etal.Promoter methylation of MGMT，MLH1 and RASSF1A tumor suppressor genes in head and neck squamous cell carcinoma: pharmacological genome demethylation reduces proliferation of head and neck squamous carcinoma cells〔J〕.Oncol Rep，2012；27(4):1135-41.

6史恩红，张东利，李鹏程.MGMT表达与替莫唑胺治疗多形性胶质母细胞瘤耐药的关系〔J〕.国际免疫学杂志，2012；35(6):453-6.

7李金磊.HIF-1α、HIF-2α在不同级别脑胶质瘤中的表达与研究〔D〕.沈阳：中国医科大学硕士学位论文，2012.

8吴长松.全反式维甲酸联合替莫唑胺对U251细胞增殖和凋亡作用的实验研究〔D〕.广州：南方医科大学硕士学位论文，2013.

9黄惠勇，林洪，苏保义，等.白藜芦醇通过NF-κB依赖途径下调MGMT增强胶质瘤细胞对替莫唑胺药物的敏感性〔J〕.中华神经医学杂志，2014；13(2)：114-20.

10孙健，杨学军，杨树源.替莫唑胺与司莫司汀治疗复发性恶性胶质瘤的随机、对照、多中心研究〔J〕.中华医学杂志，2013；93(3)：165-8.

〔2013-10-15修回〕

(编辑曹梦园)