自噬和健康长寿的研究进展

杜建财 郭忠琴 张翻弟 孙亮 朱小泉 原惠萍 杨帆 李星慧 秦娇琴 贾春媛 何本进 韩晶 杨泽※

自噬和健康长寿的研究进展

杜建财1，2郭忠琴1张翻弟1，2孙亮2朱小泉2原惠萍2杨帆2李星慧1，2秦娇琴2贾春媛1，2何本进2韩晶2杨泽2※

衰老是个体活力经历了指数的下降导致死亡的一个过程。通过对秀丽隐杆线虫分子机制的研究，极大地拓宽了我们衰老的知识。多种长寿通路控制线虫的衰老，如类胰岛素生长因子信号、TOR信号、限制饮食和线粒体活性等。最近的遗传学研究表明，自噬是一种进化保守的溶酶体降解通路，与多种长寿信号共同调控线虫的寿命。因此，我们综述了自噬在调控线虫寿命中作用的研究进展。

自噬 长寿 秀丽隐杆线虫

衰老是生命科学和生物医学研究领域最根本的主题，随着期望寿命的提高，衰老的研究就越来越重要了［1］。生物老年病学家一直认为衰老过程是受遗传控制的。衰老研究的主要目的是识别决定长寿的基因及其功能。研究线虫等生物模型已经证明:潜在衰老的分子机制是很重要的一个发现。线虫的生活周期快、寿命短、适合做遗传分析等非常适用于衰老的研究。线虫和高等真核生物一样，也经历一种可见的衰老过程［2］。近年来，越来越多的证据表明，自噬的细胞通路可能是寿命的核心调控子，并受到DAF-2胰岛素/类胰岛素生长因子-1、饮食限制和线粒体突变(如RNA干扰失活的ATP合酶-3)的影响。在近20年，线虫模型系统在阐明寿命调控的分子机制上指明了方向。

秀丽隐杆线虫是独立生存的土源性线虫。在食物充足的条件下，线虫胚胎后期的发育主要有(L1～L4)4个幼虫期和成熟期。成熟个体的平均寿命大约是2周。然而，如果食物不足或环境太拥挤(通过测量持续分泌的信息素来估算数量密度)，发育阶段就会进入特殊的第三期叫持久幼虫。持久幼虫是一个发育停滞期，能生存6个月。在持久幼虫阶段，衰老似乎受到质疑［3］。事实上，4个daf基因daf-2，age-1，daf-16和daf-18都参与调控成熟线虫的寿命［4～6］。daf-2和age-1突变体是形成持久幼虫必不可少的。然而，假如daf-2和age-1突变体在低温条件下培养，他们不会发育成持久幼虫，但是成年后会延长寿命［4～6］。在持久幼虫期，特殊延长寿命的程序被激活，这种程序在daf-2和age-1成熟个体中没有被激活。

1．自噬

自噬是在所有真核生物进化上保守的一种细胞内降解过程［1］。有三种类型的自噬:巨型自噬、微型自噬和调节介导的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。巨型自噬是一个动态过程，涉及到亚细胞膜的重构，将细胞质和细胞器分开，运送到溶酶体或液泡将其降解或循环利用［7］。我们现在讨论的就是巨型自噬，以下简称“自噬”。与之相反的是，微型自噬是溶酶体膜包含细胞质将其直接吞食。不像巨型自噬和微型自噬涉及到亚细胞膜的重构，调节介导的自噬特定用于降解细胞内蛋白，这种蛋白产生特有的五肽相同序列，并直接作用于溶酶体［5］。值得注意的是，巨型自噬是唯一已知敲除线粒体和其他细胞器的细胞通路，也是长期、易于蓄积蛋白降解的主要细胞通路。

自噬参与许多不同的生物功能，如饥饿适应、抑制肿瘤、发育和分化、细胞死亡、先天免疫和抗衰老［7］。基础水平的自噬通常发生在较低水平甚至正常生长条件下，这种条件对于“细胞管家”功能来说是很重要的［8］。通过营养饥饿、剥夺生长因子以及各种细胞内外的应激如缺氧、高温或拥挤等诱导自噬活性［9］。从酵母到哺乳动物，包括线虫，通过营养饥饿和TOR(Target of Rapamycin，TOR)的抑制强烈的诱导自噬［10］。在多细胞真核生物中，包括胰岛素、TOR、应激活化激酶和真核起始因子2a激酶信号通路等多种信号转导通路，都能反应在调节自噬活性中营养状况［9］。

自噬过程包括形成双膜结构的自噬体，通过一系列的步骤，包括诱导、形成核泡、泡的扩大、完成自噬和恢复，然后紧接着是溶酶体的融合和胞质内容物的降解。在酵母中，通过遗传筛查已经识别了30多个自噬相关基因，他们都活动在TOR激酶的下游。在正常营养条件下的酵母，TOR通过未知的机制使ATG-13(autophagy-related genes，ATG)高度磷酸化抑制ATG-13和ATG-1的相互作用。然而，在饥饿条件下，抑制作用失活，激活的ATG13-ATG-1复合物诱导了自噬［7］。自噬体形成的第一步中，分离的膜以吞噬泡的形式在吞噬泡聚集部位，分离细胞脂蛋白和细胞器［11］。酵母的Ⅲ类PI3K复合物包含VPS34和Atg6，是在泡成核过程的起始中所需的。吞噬泡膜的的延长形成了自噬体。2个泛素样蛋白系统都需要这一步［11］。ATG-8是那些系统中其中一个类泛素样蛋白，与自噬体膜相关，在自噬过程中以磷脂酰乙醇胺共轭的形式存在［11］。因此，ATG-8标记的GFP被广泛的用作标记，以绿色的小泪点显示自噬体。自噬体形成后，除ATG8以外，自噬蛋白、ATG9和ATG18都需要恢复。然后自噬体外膜与溶酶体融合，分离细胞质成分的内膜输送到溶酶体。融合泡称为自噬体，细胞质在里面被溶酶体酶降解。降解后分裂的产物，如氨基酸、游离脂肪酸释放进入细胞质，循环合成新的大分子维护细胞能量平衡［7］。

在不同的物种中发现了许多酵母ATG的同源体，包括线虫、果蝇、小鼠和人类［7］。已经发现在秀丽隐杆线虫基因组中有16个ATG的同源体，并评估了它们在自噬过程中的功能［12］。此外，近期研究已经表明，自噬在线虫的饥饿生存、持久发育、衰老、细胞死亡和神经退行性疾病中发挥重要的作用［12］。

2．自噬和线虫的长寿通路

已经发现了线虫的很多长寿基因，近期的研究指出自噬与几个高保守的长寿通路有关，包括类胰岛素信号、限制饮食和线粒体突变等。研究线虫长寿的最好通路是DAF-2胰岛素/类胰岛素生长因子-1信号通路。在2003年，首次研究线虫的自噬就表明，自噬基因bec-1(酵母ATG-6的同源体)在daf-2突变体动物中的长寿表型是必需的。随后的研究表明，atg-7，lgg-1(酵母ATG-8的同源体)，atg-12，atg-18和vps-34等5个自噬基因也是daf-2突变体延长寿命所需要的［13］。与寿命的数据一致，几个使用转基因表达的荧光自噬GFP融合LGG-1(线虫ATG-8的同源体)标记的线虫［13］的研究也表明daf-2持久幼虫期和成虫诱导了自噬。总之，这些研究表明，在线虫的类胰岛素受体络氨酸激酶daf-2丧失功能突变的长寿表型下，类胰岛素信号的降低上调了自噬。迄今为止，还没有发表检查自噬基因是否也正如人们所预料，需要age-1介导延长寿命相关报道。

悬而未决的问题是DAF-16自噬调控是否有助于DAF-2介导延长寿命。最近的一份报告表明，DAF-16/FOXO转录因子的超表达诱发线虫的自噬［14］。此外，FOXO转录因子的超表达诱导了果蝇的自噬［14］，FOXO3调控小鼠肌细胞的自噬，这些都表明FOXO转录因子在自噬诱导中保持进化上保守的作用。然而，Hansen等人发现daf-16无义突变不能阻止daf-2突变体的自噬诱导［13］。这种明显差异的可能解释就是在自噬调控中，另一个未被识别的蛋白与DAF-16作用的过度表达有关。在这种情况下，daf-2介导延长寿命对DAF-16和自噬基因的需求可能反映了DAF-16调控功能的独立自噬和自噬(能够被DAF-16独立方式激活)的双重必要性。

3．调节线虫长寿的其他通路

3.1 DAF-2胰岛素/类胰岛素生长因子-1 daf-2［11］和age-1单基因的突变明显延长了线虫的寿命。daf-2编码胰岛素类受体的络氨酸激酶，age-1编码磷脂酰肌醇激酶3(PI3K)的催化亚单位的同源体。磷脂酰肌醇激酶3(PI3K)作为络氨酸激酶二聚体生长因素受体下游，包括胰岛素受体家族。daf-2和age-1信号主要靶点是DAF-16，daf-2和age-1突变体需要DAF-16活性增强长寿。DAF-16编码一个FOXO转录因子。受类胰岛素缩氨酸的刺激，DAF-2受体激酶激活磷脂酰肌醇激酶3，依次激活丝氨酸-苏氨酸激酶蛋白，激活的蛋白激酶磷酸化。DAF-16/FOXO转录因子，导致DAF-16从细胞核转出到细胞质。然而，daf-2配合基的缺失，去磷酸化的DAF-16进入细胞核开启了一些列基因的转录，这些基因是长寿需要的，如抗氧化基因和热休克耐受基因。因此，daf-2和age-1是主要的信号分子，DAF-16是主要的转录因子，它们的功能就是控制衰老。

激活的PI3K将质膜的4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)转换为3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)。PIP3能结合各种信号蛋白包括Akt，并激活他们，PIP3的降解使PI3K信号被终止。磷酸酶PTEN(Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome TEN)使PIP3的第3位点脱磷酸化形成PIP2。daf-18编码秀丽隐杆线虫同源体PTEN，PTEN与AGE-1的活性相反。事实上，从秀丽隐杆线虫到哺乳动物，类胰岛素受体络氨酸激酶到FOXO转录因子通路都是保守的。更加有趣的是，从秀丽隐杆线虫到果蝇、小鼠等许多物种都能看到，类胰岛素信号降低可导致长寿。

DAF-16的核定位也受到其他激酶的调控，如JNK-1(c-Jun N-terminal kinase)是MAPK超家族的成员，磷酸化DAF-16并促进其向细胞核的迁移［10］。如期所愿，JNK-1的超表达导致DAF-16依赖寿命的延长。在哺乳动物中，FOXO转录因子被DNA依赖的蛋白去乙酰化酶脱去乙酰基。DAF-16也能被去乙酰化酶脱乙酰基，尽管生物学证据不足。有趣的是，线虫的去乙酰化酶Sir2.1的超表达，增加DAF-16依赖型野生线虫的寿命，表明去乙酰化酶能修饰DAF-16的活性。此外，作为转录后修饰，DAF-16通过促进应激耐受与其他不同转录因子相互作用去控制延长寿命的基因表达。作为daf-2信号下游的一个寿命核心调控子，对增加的DAF-16靶位基因和DAF-16功能调控子的识别，能进一步理解类胰岛素信号如何在线虫和其他生物中控制寿命。

3.2 限制饮食通路 限制饮食是调控线虫寿命的另一种机制。它的功能，至少说部分功能被TOR信号通路的活性降低了。秀丽隐杆线虫的基因突变导致TOR抑制延长寿命。限制饮食不能进一步延长RNA干扰TOR增加寿命，这表明，在调控线虫寿命中受TOR介导限制饮食的影响。在其他生物中也一样，TOR负向调控线虫的自噬［13］。重要的是，由于TOR活性降低，RNA干扰自噬基因阻断了寿命延长［12］。因此，限制饮食抑制TOR是可预测的，反向诱导自噬。事实上，自噬活性的增加不仅在RNA干扰TOR的动物中，也能在eat-2，eat-3限制饮食的突变体和饮食限制的野生型线虫中观察到［13］。因此，敲除RNA干扰的自噬基因抑制了eat-2突变体延长寿命并不惊讶［13］。通过限制饮食和daf-2/类胰岛素信号通路调控的核心细胞靶位是自噬，在控制线虫的寿命中非常重要。

需要注意的是，时至今日所有的研究都说明研究限制饮食调控线虫寿命需要的自噬体都是利用eat-2突变体［13］。确信通过使用传统的适合限制饮食的生理模型的细菌稀释方法得到结论，这一点至关重要。非常重要的是，基于每条通路下游不同的需求，限制饮食被认为在控制线虫寿命上与daf-2/类胰岛素信号通路是平行的。如上所述，daf-2突变体的长寿表型依赖的DAF-16，然而eat-2突变体的长寿表型是独立的DAF-16。相反，限制饮食调控动物寿命需要FOXA转录因子PHA-4。有趣的是，限制饮食诱导自噬也需要PHA-4［12］。因此，通过限制饮食来延长线虫的寿命是否是PHA-4依赖自噬是一个根本机制，换句话说，调控哺乳动物FOXA转录因子是否是限制饮食诱导自噬和/或延长寿命的决定非常重要。

3.3 线粒体突变通路 与限制饮食相似，线粒体突变也是通过DAF-16独立的形式延长寿命。atp-3和cik-1突变都会降低线粒体的呼吸并延长线虫寿命。RNA干扰atp-3和cik-1延长野生型线虫的寿命，但不能自噬突变体，表明线粒体的两个突变体都需要自噬来延长寿命。然而，在成熟期RNA干扰bec-1不能抑制线粒体atp-3和cik-1突变体长寿的表型［13］。因此，下一步的实验要证明线粒体在调控寿命时与自噬的关系。

除DAF-2胰岛素/类胰岛素生长因子-1信号通路、限制饮食和线粒体突变外，还有许多其他基因影响线虫的寿命。例如，依赖于DAF-16活性的去乙酰化酶Sir2.1超表达延长寿命。在应激状态下，Sir2.1进入细胞核并与DAF-16形成一种复合物开启了长寿基因的转录。Sir2.1延长寿命是否需要自噬尚未得到验证。然而有趣的是，其中一种哺乳动物的长寿蛋白Sirt1，与自噬蛋白包含Atg5，Atg7和Atg8以及直接脱去乙酰基的那些蛋白形成一种复合物。因此，在线虫中Sir2.1调控自噬以及Sir2.1超表达延长寿命也需要自噬的推测令人鼓舞。与Sir2.1，TAX-6或CNA-1相比，线虫的磷酸酶A蛋白是一个丝氨酸或苏氨酸蛋白磷酸酶的催化亚基，以DAF-16部分依赖的形式控制线虫寿命。丧失功能的TAX-6突变体发挥了微弱的daf-2突变表型，包括延长寿命和持续幼虫期的形成。DAF-16丧失功能的突变体不完全抑制长寿表型［14］。有趣的是，近期研究报道tax-6突变体诱导了自噬，RNA干扰自噬基因抑制了TAX-6突变体延长寿命。因此，自噬基因这在调控线虫寿命中需要磷酸酶。

4．总结和展望

在过去的几年，自从在daf-2介导延长寿命中发现了bec-1的作用，越来越多的证据表明多种不同线虫长寿突变体、长寿信号通路都需要自噬来延长寿命。然而，自噬在体内是如何进行调控、自噬的损伤是直接还是间接作用于衰老、自噬在细胞和分子水平如何延长寿命等方面，我们知道的仍然很少。我们希望继续研究线虫，同时研究其他物种，了解清楚这些问题并开拓研究衰老新的领域。

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Autophagy and Healthy Longevity Study

(DU Jiancai1，2，GUO ZHongqin1，ZHANG Fandi1，2，SUN Liang2，ZHU Xiaoguan2，YUAN Huiping2，YANG Fan2，LI Xinghui1，2，QIN Jiaoqin2，JIA Chunyuan1，2，HE Benjin2，HAN Jiang2，Yang Ze2.1.Ningxia medical university，Yinchuan 750004，China;2.Institute of geriatrics，Beijing hospital，Ministry of health，Beijing 100730，China.)

Aging is a process in which individuals undergo an exponential decline in vitality，leading to death.In the last two decades，the study of the molecular regulation of aging in Caenorhabditis elegans has greatly expanded our knowledge of aging.Multiple longevity pathways，such as insulin-like growth factor signaling，TOR signaling，dietary restriction and mitochondrial activity，control aging in C.elegans.Recent genetic studies indicate that autophagy，an evolutionary conserved lysosomal degradation pathway，interacts with various longevity signals in the regulation of C.elegans life span.Here，we review the current progress in understanding the role of autophagy in the regulation of C.elegans life span.

Autophagy，Longevity，Caenorhabditis elegans，advances

10.3969/j.issn.1672-4860.2015.05.001

2015-7-17

1.宁夏医科大学公共卫生学院 750004 2.北京医院 卫生部北京老年医学研究所 卫生部老年医学重点实验室 100730

国家自然科学基金(81061120527，81370445，81472408，81400790);卫生部公益性研究基金(201302008);国家科技部十二五支撑计划(2012BAI10B01);北京市科技新星计划(Z121107002512058)

※为通讯作者