青海省东部农区仔猪致病性大肠杆菌耐药性监测

杜银忠　沈晓英　文 英　安林昌

（青海大学，青海西宁　810016）

青海省东部农区仔猪致病性大肠杆菌耐药性监测

杜银忠沈晓英文 英安林昌

（青海大学，青海西宁810016）

用NCCLS（National committee for clinical laboratory standards）法选用14种抗生素对青海省互助、湟源、平安、大通、西宁、湟中等东部农业区地区仔猪致病性大肠杆菌进行了药物敏感性试验。结果表明，14种抗生素中抑菌作用最强的为诺氟沙星，其敏感菌株占（97/152）63.8%，其次，为氧氟沙星（96/152）63.2%，庆大霉素（92/152）60.5%；耐药菌株较多且表现为多重耐药。

仔猪致病性大肠杆菌耐药性

仔猪大肠杆菌病是由猪源致病性大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）感染引起的传染病，是兽医临床上常见的疾病之一，为控制大肠杆菌病的发生，临床上抗菌药的使用非常广泛而频繁，甚至有滥用的迹象，大肠杆菌的耐药率已大幅度上升，多重耐药菌株剧增，耐药谱增宽［1］，盲目使用抗生素带来的负面效应越来越突出，为此，采用NCCLS标准化法规对分离自青海省互助、湟源、平安、大通、西宁等地猪场仔猪致病性大肠杆菌进行了耐药性检测，以期筛选出适合于该地区或猪场使用的敏感药物，指导临床用药，对地区养猪业防治仔猪大肠杆菌病提供科学依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1病料的采集

从青海省互助、湟源、平安、大通、西宁、湟中等地区猪场采集仔猪腹泻粪样，共计265份。

1.1.2培养基及试剂

普通琼脂培养基、TSI培养基、EMB琼脂、酵母膏、营养琼脂购自北京奥博星生物技术责任有限公司；MH培养基，购自中国药品生物制品检定所；生化微量发酵管，购自杭州微生物试剂有限公司。

1.1.3实验动物

小白鼠18～24 g昆明系小白鼠，购自青海省地方病研究所。

1.1.4药敏纸片

NCCLS规定的标准药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司，抗生素种类为：头孢拉定（VI）、氯霉素（氯）、妥布霉素（妥）、庆大霉素（庆）、环丙沙星（环）、氧氟沙星（奥）、克林霉素（洁C）、头孢唑林（V）、阿莫西林（阿）、卡那霉素（卡）、诺氟沙星（氟）、麦迪霉素（麦）、万古霉素（万）、氨苄西林（氨）等14种药敏纸片（WS/T125-1999）。

1.2试验方法

1.2.1病料的采集

采集时先将棉签用无菌生理盐水蘸湿，再用棉签取腹泻仔猪的粪便装入灭菌试管并标记。

1.2.2大肠杆菌的分离纯化

将所采集的265份仔猪的粪样先用0.9%的生理盐水稀释、摇匀后用灭菌的接种环勾取1～2环接种于营养肉汤中37 ℃培养18～24 h，再从营养肉汤中勾取1～2环接种到EMB培养基上37 ℃18～24 h后挑取疑似单个菌落（紫黑色带金属光泽）进行革兰染色，镜检，将培养特性及形态、染色反应、排列均符合大肠杆菌的菌株画线接种于普通营养琼脂平板纯化后进行生化鉴定。

1.2.3大肠杆菌的生化试验

将纯化好的细菌分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、M-R、V-P、靛基质、硝酸盐、尿素、硫化氢、枸橼酸盐、半固体琼脂等生化发酵管，三糖铁培养基（TSI）。37 ℃24～48 h，观察结果。

1.2.4大肠杆菌致病性实验

生化试验符合大肠杆菌的菌株接种普通肉汤，37℃培养18h，分别腹腔接种小白鼠，0.2ml/只，观察存活情况，死亡的小白鼠经剖检取其脏器后，用EMB平板进行接种菌回收实验，其培养特性、形态、染色反应均符合大肠杆菌的菌株定为致病性大肠杆菌。

1.2.5药敏试验

取致病性大肠杆菌MH纯培养物，分别用灭菌生理盐水洗下稀释并与麦氏比浊管进行比浊，选取5×108个/ml浓度，15 min内用无菌棉试纸蘸取已校正的菌液，涂布在4 mm厚MH平板表面，每块平板涂布3次，每次旋转60°，均匀接种，干燥平板3～5 min后，分别贴上各种药敏纸片，每块平板贴3片，37 ℃培养18～24 h后观察结果。判定标准参照美国实验标准委员会（NCCLS）药敏纸片扩散法规与文献［2-5］。

2　结果

2.1致病性大肠杆菌分离的情况

从265份粪样中共分离鉴定出致病性大肠杆菌152株。

2.2药敏试验

14种抗生素中抑菌作用最强的为诺氟沙星，其敏感菌株占（97/152）63.8%，其次为氧氟沙星（96/152）63.2%、庆大霉素（92/152）60.5%、环丙沙星（90/152）59.2%、头孢唑啉（79/152）52.0%、妥布霉素（78/152）51.3%、氯霉素（73/152）48.0%。152株菌株对抗生素均表现出不同程度的耐药性，其中2重耐药13株（13/152，8.6%），3重耐药16株（16/152，10.5%），4重耐药13株（13/152，8.6%），5重耐药16株（16/152，10.5%），6重耐药10株（10/152，6.6%），7重耐药9株（9/152，5.9%），8重耐药12株（12/152，7.9%），9重耐药11株（11/152，7.2%），10重耐药5株（5/152，3.3%），11重耐药17株（17/152，11.2%），12重耐药8株（8/152，5.3%），13重耐药4株（4/152，2.6%），14重耐药7株（7/152，4.6%）。

3　讨论

（1）152株分离自青海省互助、湟源、平安、大通、西宁、湟中等地区的仔猪致病性大肠埃希菌耐药性监测结果表明对诺氟沙星敏感菌株较多，占（97/152）63.8%，而对大部分常用抗生素表现为耐药，如在耐药菌株中，耐麦迪霉素（122/152）80.3%、耐克林霉素（109/152）71.7%、耐阿莫西林（105/152）69.1%、耐万古霉素（98/152）64.5%、耐氨苄西林（96/152）63.2%。在一定时间内，此结果对本地区猪场防治致病性大（2）152株菌株对14种药物均有不同程度的耐药性，且表现为多重耐药，2～6重耐药菌株占44.7%，7～10重耐药菌株占24.3%，11重耐药17株占11.2%，12重耐药8株占5.3%，13重耐药4株占2.6%，对所选抗生素全部耐药菌株7株占4.6%，有如此高的耐药比例及众多多重耐药菌株，兽医工作者应引起足够的重视。

肠杆菌病提供了科学的用药依据。本次试验结果与四川、重庆等地大肠杆菌耐药性检测试验结果［6，7］比较，敏感菌株比例降低，耐药菌株比例增多。

（3）规模化猪场由于疾病的压力而大量使用抗生素，而细菌的耐药性通过染色体或质粒介导在细菌间传播和扩散，应定期对本猪场分离菌株进行抗生素敏感性的监测，以指导临床用药。

［1］ 朱力军.动物大肠杆菌耐药性的变化趋势［J］.中国兽药杂志，2001，35（2）：16-18.

［2］ 王辉，陈民钧，徐英春，等.简要介绍美国NCCLS药敏试验纸片扩散法法规（续）［J］.中华医学检验杂志，1995，18（2）：118-124.

［3］ 吕绳凯，葛平.1998年美国NCCLS纸片法药敏试验法规中主要变动［J］.上海医学检验杂志，1999，14（1）：53

［4］ 吕绳凯，葛平，陈蓉.2001年NCCLS药敏标准中的主要变动［J］.上海医学检验杂志，2001，16（3）：184-185.

［5］ 孙长贵，曾贤铭，成军.2005年CLSI/NCCLS文件M100-S15主要更新内容介绍［J］.临床检验杂志，2005，23（5）：382-386.

［6］ 赖婧，刘洋，汪宇，等.800株不同动物源大肠杆菌的耐药性监测［J］.兽医研究，2013，185：50-52.

［7］ 李刚.邹平地区鸭源大肠杆菌的分离鉴定及耐药性检测［D］.山东农业大学，2013.

青海省农牧厅兽医局科技项目，项目编号NMSY-2013-04

杜银忠（1970-），男，教授，从事预防兽医学工作。