叶酸代谢相关基因多态性在母胎医学领域的应用及相关性研究

陈小梅，韩淑芬

(1.河北唐山市滦南妇幼保健院，河北 唐山 063500； 2.河北省唐山市妇幼保健院，河北 唐山 063500)

【出生缺陷预防】

叶酸代谢相关基因多态性在母胎医学领域的应用及相关性研究

陈小梅1，韩淑芬2

(1.河北唐山市滦南妇幼保健院，河北 唐山 063500； 2.河北省唐山市妇幼保健院，河北 唐山 063500)

目的 探讨叶酸代谢相关基因多态性在母胎医学领域的应用及相关性研究。方法 该研究应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，研究叶酸代谢与唐氏综合征(DS)、非综合征性唇腭裂(NSCL/P)之间的关系。结果 DS与叶酸代谢之间，经Logistic回归分析，携带MTHFR TT 基因型母亲孕育DS患儿的风险是CC基因型的2.41倍(OR=2.41，95%CI：1.32～9.48，P<0.05)，MTRR基因GG基因型母亲生育DS患儿的风险增加2.74倍(OR=2.74，95%CI：1.23～8.38，P<0.05)。NSCL/P与叶酸代谢之间，经Logistic回归分析，携带CBS基因的rs397589 TT 基因型使NSCL/P的患病风险提高2.51倍(OR=2.51，95%CI：1.23～14.38，P<0.05)。结论 采用分子医学检测，在一定程度上能够解释叶酸利用能力障碍所导致的胚胎发育异常，但是也有一定的局限性。

叶酸代谢；唐氏综合征；非综合征性唇腭裂；母胎医学

据调查研究表明，活产新生儿中有5%左右存在各种先天缺陷，而新生儿死亡约20%由先天畸形导致[1-2]。人类自身不能合成叶酸，必须依赖食物供给，叶酸(folic acid，FA)又称蝶酰谷氨酸，是人体必不可少的营养物质，其主要生物学功能是作为甲基供体参与细胞内的甲基化反应和脱氧核糖核酸的合成，叶酸不能被人体直接利用，必需通过一系列活化才能发挥其生理功能。叶酸利用代谢异常是母婴医学中导致胚胎发育异常的环境因素之一，常见的胚胎发育异常有(neural tube defect，NTD)[3]、唐氏综合征(down syndrome, DS)[4]、非综合征性唇腭裂(non syndromic cleft lip and cleft palate，NSCL/P)[5]、先天性心脏病[6-7]等。本文主要探讨叶酸代谢转运过程中，利用分子医学检测的手段对叶酸代谢与DS、NSCL/P之间的关系研究。

1 材料与方法

1.1 研究对象

DS研究：病例组为河北唐山市滦南妇幼保健院3年来就诊治疗的DS患者母亲血样80份；对照母亲血样83份，与病例母亲生活环境相近，生育过孩子，无不良生育史，染色体核型正常。

NSCL/P研究：病例组为河北唐山市滦南妇幼保健院近3年来就诊治疗的NSCL/P患者77例，年龄12.14±8.79岁，男40例，女37例；对照组75例，年龄11.96±9.14岁，男38例，女37例，排除伴有其他畸形的综合性唇腭裂以及其他器质性疾病。

本研究经伦理委员会批准，未违反医学伦理学原则，所有患者均自愿加入本研究并签署知情同意书。

1.2 研究方法

本研究应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，对还原叶酸载体(reduced folate carrier1，RFC-1)和蛋氨酸合酶(methionine synthase，MTR)基因多态性进行检测，探讨叶酸利用能力相关基因MTHFR 677C>T、MTRR 66A>G、RFC-1 80G>A和MTR 2756A>G与DS的关系。

1.2.1 标本的收集

所有受试对象均与住院后次日清晨采血，均取肘静脉血5mL置于真空EDTA-K2抗凝管中，以1 000r/min离心获取血小板丰富的血浆，接着以1 800r/min离心7min从而获取血小板贫瘠血浆。真空EDTA-K2抗凝管中，以1 500r/min离心获取血小板丰富的血浆，接着以2 500r/min离心8min从而获取血小板贫瘠血浆。

1.2.2 主要试剂及仪器

主要试剂：RNA提取物试剂盒购于美国ABI公司；反转录试剂盒购于美国LC Science公司；实时荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生生物有限公司。仪器：台式离心机(Eppendorf Mini spin，Beckman公司)、紫外交联仪(BIO-RAD公司)、凝胶成像分析仪(美国ABI公司)以及定量PCR仪(uVP公司)。

1.2.3 实验步骤

1.2.3.1 组织与血浆中RNA的提取 取500μL血小板贫瘠血浆置于1.5mLEP管中，加入20μL的Proteinase K消化液进行消化，然后按照Trizol LS试剂盒说明书进行后续操作，使用NanoDrop 1 000检测血浆中总RNA的浓度。

1.2.3.2 聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性反应 首先配置逆转录反应体系，即：无RNA酶双蒸水14.75μL，0.5μLRNase抑制剂，1μL逆转录酶。将100ng总RNA、2μLRT引物以及5μLBuffer加入到上述反应体系中，在43℃50min中，95℃5min中进行逆转录反应。，再进行PCR反应：需要5μLcDNA、1μL上游引物以及下游引物、12.5μL 2×Master Mix，补充双蒸水至25μL，95℃预变性5min中，95℃变性25s，50℃退火30s，70℃延伸40s，35个循环，72℃后延伸5min。RT引物以及PCR引物见表1。记录各个反应管中的荧光信号所设立的阈值时循环数(CT值)，将原始数据取3次以上重复扫描后取平均值，以U6作为内参进行归一，计算MTHFR 677C>T、MTRR 66A>G、RFC-1 80G>A和MTR 2756A>G相对表达情况，应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，对CBS和SHMTI基因上的两个单核苷酸多态性(SNP)rs397589和rs1979276进行检测。MTHFR-C677T、MTHFR-A1298C和MTRR-A66G凝胶图像显示见附图。

表1 叶酸代谢相关基因以及U6的RT-PCR引物序列

Table 1 Folate metabolism-related genes and RT-PCR primer sequences of U6

1.3 统计学方法

所有数据分析采用SPSS 19.0软件处理。应用拟合优度χ2检验，分析基因频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，确认样本的群体代表性。基因型以及基因频率分布的比较采用Pearsonχ2检验。关联分析用χ2检验和Logistic回归分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 唐氏综合征与叶酸利用能力的关系

2.1.1 等位基因频率的分布

MTHFR 677C>T、MTRR 66A>G、RFC-1 80G>A和MTR 2756A>G等位基因频率的分布经Hardy-Weinberg平衡检验病例组和对照组各基因型达到遗传平衡(均P>0.05)，具有群体代表性。MTHFR、MTRR、RFC-1和MTR等位基因频率的差异均无统计学意义(χ2值分别为1.438、1.185、0.413、0.253，均P>0.05)，见表2。

2.1.2 MTHFR、MTRR、还原叶酸载体和蛋氨酸合酶各基因型与唐氏综合征发生的关系

经Logistic回归分析，携带MTHFR TT 基因型母亲孕育DS患儿的风险是CC基因型的2.41倍(OR=2.41，95%CI：1.32～9.48，P<0.05)，而CT合并TT基因型未显著增加DS发生的风险。以AA合并AG基因型为参照，MTRR基因GG基因型母亲生育DS患儿的风险增加2.74倍(OR=2.74，95%CI：1.23～8.38，P<0.05)，见表3。

表2 MTHFR 677C>T、MTRR 66A>G、RFC-1 80G>A和MTR 2756A>G等位基因频率的分布[n(%)]

Table 2 Allele frequency distribution of MTHFR 677C>T, MTRR 66A>G, RFC-1 80G>A and MTR 2756A>G [n(%)]

附图 凝胶图像显示检测多态性PCR-RFLP图谱

Fig. Gel image showing PCR-RFLP pattern of the examined polymorphism

表3 MTHFR、MTRR、RFC-1和MTR多态性与DS关系的Logistic回归分析

Table 3 Logistic regression analysis of the relationship between MTHFR, MTRR, RFC-1, MTR polymorphism and DS

2.2 非综合征性唇腭裂与叶酸利用能力的关系

2.2.1 CBS和SHMT1基因上两个SNP的等位基因频率的分布

经Hardy-Weinberg平衡检验病例组和对照组各基因型达到遗传平衡(P>0.05)，两个SNP位点基因频率均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性。两个SNP位点基因频率的差异均无统计学意义(χ2值分别为3.423、1.827，均P>0.05)，见表4。

表4 CBS和SHMT1基因两个SNP的等位基因频率的分布[n(%)]

Table 4 Allele frequency distribution of two SNP on CBS and SHMT1 genes[n(%)]

2.2.2 CBS和SHMT1基因上两个单核苷酸多态性的等位基因与非综合征性唇腭裂发生的关系

经Logistic回归分析，携带CBS基因的rs397589 TT 基因型使NSCL/P的患病风险提高2.51倍(OR=2.51，95%CI：1.23～14.38，P<0.05)，而GT和GG基因型未显著增加NSCL/P发生的风险，见表5。

表5 CBS和SHMT1基因上两个SNP的等位基因多态性与NSCL/P关系的Logistic回归分析(n)

3 讨论

3.1 叶酸代谢基因与唐氏综合征的关系

本研究结果发现，在分子医学检测基因型模式下，携带MTHFR TT 基因型母亲孕育DS患儿的风险是CC基因型的2.41倍(P<0.05)，而CT合并TT基因型未显著增加DS发生的风险。以AA合并AG基因型为参照，MTRR基因GG基因型母亲生育DS患儿的风险增加2.74倍(P<0.05)。虽然引起DS发生的染色体不分离机制至今还不明确，但本研究显示，叶酸代谢相关基因特别是MTHFR、MTRR突变与DS发生相关。还原叶酸载体-1(reduced folate carrier，RFC-1)帮助5-甲基四氢叶酸(methyltetrahydrofolate，5-MeTHF)进入细胞，RFC-1基因变异可引起叶酸转运缺陷，进而可能导致与叶酸代谢有关的出生缺陷发病风险增加。结合本研究的发现，RFC-1 80G>A多态性单独分析可能较少影响叶酸代谢，与DS的发生风险无显著关联，但不能排除其与其他叶酸代谢基因之间存在交互和修饰效应。

本研究结果发现，对CBS和SHMT1基因进行了trans-phase基因-基因相互作用分析，发现携带CBS基因的rs397589 TT 基因型使NSCL/P的患病风险提高2.51倍(P<0.05)。说明在NSCL/P的发生中，这两个基因的相互作用发挥关键的作用。如果这两个代谢酶基因存在与疾病有关的相互作用，一方面会影响Hcy的转硫代谢，造成Hcy在体内堆积，形成Hcy血症[8]；另外一方面，会影响四氢叶酸的功能[9]，破坏DNA的正常甲基化和人类基因组的完整性，使得这种相互作用成为NSCL/P形成的潜在危险因素。

3.2 叶酸代谢基因的局限性

在母婴医学领域，采用分子医学检测手段，在一定程度上能够解释叶酸利用能力障碍所导致的胚胎发育异常，但是也有一定的局限性。由于叶酸代谢和蛋氨酸合成通路涉及的相关代谢酶和基因很多，还应该对多个相关基因同时进行基因变异筛查。本研究在母婴医学领域罕有报道，可以相信随着分子医学检测水平的不断提高，叶酸代谢障碍所导致的胚胎发育异常将不再是严重的社会问题。

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[专业责任编辑：于学文]

Application of polymorphism of folate metabolism related gene in molecular medical examination of maternal-fetal medicine

CHEN Xiao-mei1, HAN Shu-fen2

(1.ChildHealthHospitalofLuannanofTangshanCity,HebeiTangshan063500,China; 2.ChildHealthHospitalofTangshanCity,HebeiTangshan063500,China)

Objective To investigate the application of polymorphism of folate metabolism related gene in molecular medical examination of maternal-fetal medicine.Methods Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method was used to study the relationship between folate metabolism and Down’s syndrome (DS) as well as non syndromic cleft lip and palate (NSCL/P).Results Logistic regression analysis showed that the risk of mothers carrying TT genotype of MTHFR gene was 3.62 times of that of the mothers carrying CC genotype in procreating children with DS (OR=2.41,95%CI:1.32-9.48,P<0.05), and the risk of mothers carrying GG genotype of MTRR gene increased by 2.74 times in procreating children with DS (OR=2.74,95%CI:1.23-8.38,P<0.05). Logistic regression analysis indicated that the risk of NSCL/P among mothers carrying rs397589 TT genotype of CBS gene enhanced 2.765 times (OR=2.51,95%CI:1.23-14.38,P<0.05).Conclusion Molecular medical examination means, to a certain extent, can explain the abnormal embryonic development caused by folic acid use disability, but there are some limitations.

folate metabolism; Down’s syndrome (DS); non syndromic cleft lip and palate (NSCL/P); maternal-fetal medicine

2014-06-25

陈小梅(1974-)，女，主治医师，主要从事妇产科临床工作。

韩淑芬，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.01.048

R715.5

A

1673-5293(2015)01-0125-04