蜜蜂个体发育过程中特定肠道菌的形成

郭军 李继莲 吴杰编译

（中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093）

蜜蜂个体发育过程中特定肠道菌的形成

郭军 李继莲 吴杰编译

（中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093）

研究表明，成年工蜂体内有一些特定的益生菌落，它们对蜜蜂健康起到了至关重要的作用。在这些菌群中，Beta、Firm-5和Gamma-1（BFG）是三种主要的种系型。采用实时定量PCR（qPCR）和荧光原位杂交（FISH microscopy）技术研究了这三种种系型在蜜蜂生活史中和不同肠道器官中的分布和丰富度。成年工蜂（出房后9～30天）包含大量的BFG菌落群系，而蜜囊和中肠中很少有这些菌群，但回肠和直肠中则包含95%以上的BFG菌落。回肠中菌群分层分布，其中Beta和Gamma-1种系型占多数，填满了肠道的纵行皱褶部位。采用16S rRNA基因的研究结果进一步清楚地表明中肠、回肠和直肠菌群分布有所不同。与老龄工蜂相比，幼虫和刚出房的工蜂几乎不包含细菌，蜂粮中也缺少大多数的菌型。通过实验检测细菌传播路线，表明新蜂可通过接触老蜂、接触蜂巢或通过子脾巢房获得细菌，并且这些途径的传播方式也不一致。

1 引言

消化器官内的微生物群落对动物健康有着很大的影响。尽管致病菌对蜜蜂健康有不良影响，但共生菌的存在可引起最初的免疫反应，抵抗入侵的病原体，还能增加营养。肠道菌群随着宿主环境、饮食和年龄而变化，在不同肠道位置也不断变化。很多研究对肠道菌的研究只反映了单一的样品，对肠道菌的时空变化动态的研究很少，也缺乏这方面的相关信息。

社会性昆虫蜜蜂（Apismellifera）是世界范围内重要的授粉昆虫，过去十年由于蜜蜂大量消失引起人们对蜜蜂健康的广泛关注。在西方蜜蜂中，成年工蜂肠道内栖息着9类特定的细菌种系，这些细菌占细菌总数的95%以上，这一结果的获得是通过非培养的方法并在不同环境、不同地理位置和不同的宿主基因型等条件下反复实验得来。这种基于非培养的方法对同一特定细菌类型的反复观察表明肠道菌中的大部分成员通过蜂箱内个体之间相互传播，而不是从箱外环境中获取。另外，这些观察还表明共生关系对蜜蜂来说至关重要。截止目前，还没有研究报道细菌具体在哪个肠道器官内或肠道菌在蜜蜂个体发育中是如何变化的。由于西方蜜蜂（Apismellifera）这种社会性昆虫复杂的发育和社会行为，导致其肠道菌经历了生理上和营养环境的变化。另外，成年蜜蜂肠道包括四个主要部分（蜜囊、中肠、回肠和直肠），并在食物分解代谢和吸收上提供了不同的功能，同时也在不同环境下提供了一些共生菌。成年工蜂在不同日龄阶段执行一些连续的任务，这使得它们可能面对不同的微生物。年轻的工蜂在箱内哺育幼虫，较老点的工蜂随着蜜源的变化采集花粉和花蜜。与成年蜂相比，西方蜜蜂的幼虫具有一个不连续的肠道，即前肠（蜜囊和中肠）和后肠（回肠和直肠）直到化蛹前才相连，并在此时才进行第一次排泄。蜜蜂幼虫生活在单一的一个巢房中，哺育蜂为幼虫饲喂高营养的王浆和少量的花粉和蜂蜜。本研究中，将使用不依赖细菌培养的方法来列举和形象化不同日龄和不同肠道器官部位的微生物，重点集中在蜜蜂（Apismellifera）肠道菌中的三个主要分类群的丰富度上。

2 材料和方法

2.1 采用qPCR估计细菌丰富度

样本于2009年11月取自美国亚利桑那州图森市（Tucson）的美国农业部卡尔·海登（Carl Hayden）蜜蜂研究中心（USDA-CHBRC）的2群蜜蜂。为了获得已知日龄的成年工蜂，选1脾封盖子脾，抖掉成年蜜蜂，装入笼中，放入温度保持为34°C并具有一定湿度的恒温培养箱（模拟箱内条件），保持箱内为黑暗环境，蜂群放入培养24 h。每群蜂分别取5只刚出房的工蜂(NEWs)（1日龄蜜蜂），同时采用Testor公司的标记产品（Testor Corp.,Rockford,IL）对50只新出房的工蜂进行标记，然后放回原蜂群，让这些工蜂自然成熟。随后，在第9天和第30天分别采集到5只和3只标记的工蜂。样品存入75%酒精-20℃存储。DNA提取时，对肠道器官（如蜜囊，中肠，回肠和直肠）进行解剖并用无菌镊子和解剖剪刀将这四部分分开。参考Martinson等方法进行DNA提取和量化，将DNA稀释至75 ng/μl进行标准PCR和定量PCR(qPCRs)。为验证所提DNA具有足够的质量进行PCR，采用引物efs599和efa923对A.mellifera的ef1α基因（elongation factor 1-alpha gene）的一段约600 bp的片段进行扩增作为对照。

从16S rRNA基因序列设计引物，扩增出的产物片段约100～250bp，主要用于检测在蜜蜂肠道菌中最能持续观察到的和最丰富的三种细菌类群。这些特定的种系型（或种）在先前的研究中被提到，即Beta,Firm-5,和Gamma-1,使用BFG种系型作为这三类细菌类群的通称，制作标准曲线并采用Oliver等文献中的方法在Roche Lightcycler荧光定量扩增仪上进行反应。

2.2 荧光原位杂交（FISH）的显微检测

从USDA-CHBRC（亚利桑那州图森市，2010年8月）的同一蜂群中按以下四种日龄分组取样，每组取2只:未封盖的5日龄幼虫、刚出房工蜂、哺育蜂和采集蜂。解剖成年蜂的消化器官病放置到一个滤纸条上以促进样品固定。将肠道组织固定在4%的多聚甲醛中2～3 h（成年肠道）或者室温过夜（幼虫），用1×PBS (phosphate-buffered saline，PBS，磷酸盐缓冲盐水)冲洗。样品通过真空渗入（Tissue-Tek VIP tissue processor(Sakura Finetek USA Inc.,Torrance,CA)）嵌入石蜡，采用一次性刀片切掉5μm的部分组织安装在Epic Plus slides上(Epic Scientific,Tualitin,OR)。根据细菌种系型的16S rRNA基因设计特定和专有的的FISH探针。在探针杂交前将切片放在60°C中孵化30min以熔化清除石蜡，然后在二甲苯中冲洗5 min，冲洗2次，随后在95%和75%酒精中分别洗7min，最后在双蒸水(ddH2O)中漂洗5min。

按照Daims等报道的方法同时开展探针杂交。采用共聚焦显微镜（Zeiss 510 Meta）观察切片的光谱成像。采用上述方法，观察各个组织在没有探针情况下的自发荧光成像情况。观察成年蜂样品的各个器官和幼虫中肠的两个位置。

2.3 幼虫中细菌的PCR诊断

为了确定幼虫中细菌微生物群的存在与否及特性，采用通用引物和特异性引物对DNA样品进行扩增。样本（3日龄幼虫，5日龄幼虫和新出房工蜂）采自位于美国马里兰州贝茨维尔（Beltsville）的美国农业部蜜蜂研究实验室（USDA-BRL），从2群健康群和1群感染欧幼病（Melissococcus plutonius）的蜂群中取样。其中健康蜂（5日龄幼虫和哺育蜂）取自位于亚利桑那州的美国农业部卡尔海登蜜蜂研究中心（USDA-CHBRC）以及耶鲁大学西校区（耶鲁大学，西汉文）。提取表面消毒过的蜜蜂幼虫DNA，采用上文所述方法，利用真核生物ef1α引物对所提DNA进行扩增以验证DNA质量。利用27f-short和1507r通用引物扩增细菌检测细菌是否存在。采用通用引物产生扩增子的样本继续用7对引物（已经在蜜蜂上发现的肠道微生物群，即Alpha-1,Alpha-2.1,Alpha-2.2,Beta,Firm-4,Firm-5,和Gamma-1）扩增特异性种系型（引物序列和反应条件见文献Martinson等(2012)）。所有的PCR扩增检测（1%琼脂糖凝胶电泳,100 V,50min）都设置一个阳性对照（成年工蜂肠道DNA）和阴性对照（ddH2O）。

2.4 评估新出房工蜂特有微生物群的来源

为确定新出房工蜂的微生物群的来源，采用两个笼子进行实验：巢框笼（能将带有子脾和蜂粮的巢脾围起来的笼子），杯状笼子（将工蜂关入笼子，放入手工搜集的蜂粮）。在对杯状笼子进行分析时，将蛹后期的蜜蜂蛹从封盖子脾中移出放入笼中并在34°C和高湿环境下培养（模拟蜂群环境），保证新出房工蜂并未与蜂箱环境或老年工蜂接触（这种新出房的工蜂也用颜料标记）。6只新出房的工蜂分别放入上述两个笼子，每笼放3只（按照Evans等报道的方法制作）所有笼中提供1∶1灭菌糖水（0.25μm的过滤器过滤灭菌）和未加工的蜂粮让其随意进食。在所有的笼类型中，允许蜜蜂在其中生存9天，之后放入95%酒精保存。在每天的检查中，搜集在第9天前死亡的蜜蜂，将其放入95%的酒精中。提取DNA，采用随后介绍的步骤中的引物进行扩增。

刚出房的工蜂在实验室饲养、无哺育蜂哺育并饲喂未加工蜂粮的条件下，蜂粮被实验性作为特色微生物群的来源。另外，两个样本的蜂粮，分别来自7个巢脾的巢房中的蜂粮混合物，对这些蜂粮DNA中特定种系型直接进行PCR。实验室饲养条件下，有3只哺育蜂（和NEWs同群采集的工蜂），饲喂未加工的蜂粮，这些老年工蜂被认为是特定微生物的来源。评定是否这些哺育蜂将其肠道混合物添加到蜂粮中，可能引入特定微生物到实验室饲养的新出房工蜂所在笼中。

为了评估蜂箱材料（如巢脾和子脾巢房的封盖）在引入微生物中的能力，在实验室中让蜜蜂蛹在巢框笼中孵化，无成年工蜂。这些新出房的工蜂用油漆标记，并用于巢框笼测定。为了评价/评估，特定微生物从蜂箱材料中对新出房工蜂的转移作用，20只标价的新出房工蜂被放置在巢框笼中。为了评定蜂箱材料和哺育蜂的联合转移微生物作用，20只新出房工蜂和20只老年哺育蜂（从同一群中采集，并标记不同颜色）被放置在巢框笼中。

2.5 454焦磷酸测序法分析Apismellifera肠道细菌的组成

解剖3只9日龄和1只30日龄蜜蜂的特定肠道器官，提取DNA，按上述介绍的方法采用qPCR方法分析，并进行454焦磷酸测序。采用通用引物926f和1492r从每一个样品的16S rRNA基因中扩增一段约～450 bp的部分序列。每一个样品给定一个条形码序列，按照Ochman等描述的方法进行高通量测序反应（454 FLX Titanium系统，罗氏应用科学，印第安纳波利斯）。测序完成后，采用QIIME（一个专门用于分析微生物高通量测序数据的多样化统计软件，如alpha及beta多样性统计）进行分析。原始454 output被分成样品，移除条形码和引物序列，为达到质量和长度（最小质量分数为25，保留序列在460～600 bp之间），对产生的序列进行过滤。序列进行去离子化，挑出97%的序列相似性分类操作单元（operational taxonomic units, OTUs）并进行比对，移除不能正确比对的非细菌OTUs。Alpha多样性获得主要在Mothur软件中获得。将OTUs作为一种特性种系群进行归类，或者在GenBank中进行Blastn搜索。采用R语言中的Gplots程序包的Heatmap.2程序展示一个样品中频＞0.05%OTUs，或者在GenBank核酸数据库中采用Blastn比对Apismellifera的特征种系型。

（未完待续）