宫颈癌新辅助化疗前后PHD3、HIF-1和NF-κB的表达及意义

杨海涛，林 毅，钟惠珍

(1.宁波市病理诊断中心，浙江 宁波 315000；2.宁波市妇女儿童医院，浙江 宁波 315000)

宫颈癌新辅助化疗前后PHD3、HIF-1和NF-κB的表达及意义

杨海涛1，林 毅2，钟惠珍2

(1.宁波市病理诊断中心，浙江 宁波 315000；2.宁波市妇女儿童医院，浙江 宁波 315000)

目的 探讨脯氨酸羟基化酶3(PHD3)、缺氧诱导因子-1(HIF-1)和核转录因子κB(NF-κB)在宫颈癌新辅助化疗前后癌组织中的表达分布，及其在预测肿瘤耐药性和预后中的临床意义。方法 选取确诊为宫颈癌患者60例，术前均行2个疗程紫杉醇加顺铂(TP)方案化疗。应用SP免疫组织化学法检测60例患者化疗前后癌组织中PHD3、HIF-1和NF-κB的蛋白水平，并进行相关分析。结果 PHD3、NF-κB蛋白在宫颈癌组织及正常宫颈组织中均有表达分布；HIF-1在正常宫颈组织中基本无表达，而在宫颈癌组织中明显表达。在正常宫颈组织中，PHD3和NF-κB蛋白表达分布显著低于在癌组织中(χ2值分别为5.372，4.521，均P<0.05)。PHD3、HIF-1和NF-κB蛋白阳性表达与宫颈癌不同病理分级、临床分期及淋巴转移情况密切相关，差异均有统计学意义(χ2值分别为6.193、4.463、11.854，均P<0.05)。化疗后宫颈癌组织中HIF-1和NF-κB表达较化疗前均有所降低，而PHD3的表达较化疗前升高，差异均有统计学意义(χ2值分别为6.112、7.532，均P<0.05)。PHD3、HIF-1和NF-κB表达阳性者与阴性者化疗有效率比较差异均有统计学意义(χ2值分别为11.726、7.205，均P<0.05)。结论 PHD3、HIF-1和NF-κB可以作为判定宫颈癌侵袭能力及预判化疗有效的指标之一，对宫颈癌的预后判断具有重要意义。

宫颈癌；脯氨酸羟基化酶3；缺氧诱导因子-1；核转录因子κB

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，早期以手术治疗为主，中晚期大多采用同步放化疗。近年来，宫颈癌的发病呈年轻化趋势。随着一些新型化疗药物的研制成功及临床研究发现其对许多宫颈癌患者具有良好疗效，宫颈癌的化疗越来越受到临床医生的重视。

新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy，NACT)是指在手术或放疗前所进行的辅助性化疗，由于其具有缩小肿瘤体积、降低手术风险、减少微转移及不良预后因素等作用，目前已成为宫颈癌综合治疗中的一大亮点。尤其对局部晚期宫颈癌，NACT联合手术，不仅可改善预后，还可保留卵巢和阴道功能。然而，由于肿瘤本身及个体间异质性的存在，不同个体间化疗疗效仍存在很大差异，有文献报道约15%～35%的宫颈癌患者对NACT不敏感且通过改变化疗方案并不能显著改善这种状况[1]。临床实践表明，患者的预后及生存率取决于肿瘤对NACT药物的反应性，对药物不敏感者采用化疗不仅会贻误治疗时机，而且还可能诱导对放疗不敏感，影响预后。为使更多的患者能从NACT中受益，探索可预测宫颈癌化疗敏感性生物学指标成为该领域近年来研究的热点。

本研究通过采用免疫组化法检测宫颈癌患者行NACT前后癌组织及癌旁正常组织中脯氨酸羟基化酶3(PHD3)、缺氧诱导因子-1(HIF-1)和核转录因子κB(NF-κB)的表达，探讨其在预测肿瘤的耐药性及预后的临床意义。

1 对象及方法

1.1 研究对象

全部标本均来自2011年1月至2013年8月在宁波市妇女儿童医院妇科就诊确诊为宫颈癌的患者60例，年龄32～68岁，中位年龄46岁；原发肿瘤直径大于4cm，临床分期为Ⅰb2～Ⅱa期，无化疗禁忌，术前均行2个疗程紫杉醇加顺铂(TP)方案化疗：紫杉醇175mg/m2滴注3小时，随后滴注顺铂(DDP)75mg/m2，疗程间隔3周。化疗后3周行手术治疗，取化疗前及手术后肿瘤组织待检测，观测化疗前后肿块大小，以及距离癌组织2cm以外的癌旁正常宫颈组织为正常宫颈对照。

1.2 实验方法

标本用10%甲醛固定，石蜡包埋，切成4μm厚的石蜡切片，65℃烘烤，脱蜡，采用免疫组化染色SP法测定PHD3、HIF-1和NF-κB的表达，严格按照试剂盒说明操作，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照：3%过氧化氢37℃孵育10分钟灭活内源性过氧化物酶，PBS洗涤；微波修复抗原，PBS洗涤；10%山羊血清封闭，室温孵育10分钟，用1:100稀释的PHD3、HIF-1和NF-κB多克隆抗体4℃过夜孵育，PBS洗涤，加生物素标记的抗人IgG抗体室温孵育30分钟，PBS冲洗，辣根过氧化物标记的链霉卵白素室温孵育30分钟，PBS冲洗，二氨基联苯胺(DAB)染色，苏木素复染，封片，镜下观察。

1.3 判定标准

1.3.1 化疗疗效判断标准

参照世界卫生组织制定的疗效判定标准，肉眼观察评估肿瘤大小，化疗后与化疗前相比肿瘤最大直径缩小≥30%或两垂直径线乘积缩小≥50%者为有效，否则为无效。

1.3.2 免疫组化判断标准

PHD3、HIF-1和NF-κB阳性染色的判定标准为细胞质或细胞核内检测出棕黄色颗粒。随机选取5个有代表性的视野计数200个细胞，若阳性细胞占同类细胞的百分比小于10%即为阴性。

1.4 统计学方法

应用SPSS 10.0统计软件分析数据，计数资料采用χ2检验比较各组间蛋白表达差异，相关性比较采用Spearman等级相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各指标在宫颈癌组织及正常宫颈组织中的表达分布

免疫组化结果显示PHD3、NF-κB蛋白在宫颈癌组织及正常宫颈组织中均有表达分布，HIF-1在正常宫颈组织中基本上无表达，在宫颈癌组织中明显表达。正常宫颈组织中PHD3和NF-κB蛋白的表达分布均显著低于癌组织(χ2值分别为5.372，4.521，均P<0.05)，见表1。

表1 不同宫颈组织中PHD3、HIF-1和NF-κB蛋白的表达分布比较[n(%)]

Table 1 Comparison of expression distribution of PHD3,HIF-1 and NF-κB in different tissues of cervix [n(%)]

2.2 各指标表达与宫颈癌临床病理特征的关系

PHD3、HIF-1和NF-κB蛋白阳性表达分布与宫颈癌不同临床分期、病理分级及淋巴转移情况密切相关，经比较差异均有统计学意义(均P<0.05)，而与患者年龄无关(P>0.05)，见表2。

表2 PHD3、HIF-1和NF-κB蛋白表达分布与宫颈癌临床病理特征的关系比较[n(%)]

Table 2 Relationship between the expression distribution of PHD3, HIF-1 and NF-κB and the clinical pathological characteristics of cervical cancer[n(%)]

2.3 各指标在宫颈癌组织中表达的相关性

在60例宫颈癌组织中，PHD3与HIF-1及NF-κB的表达呈正相关(r值分别为0.573、0.629，均P<0.05)，HIF-1的表达与NF-κB表达呈正相关(r=0.697，P<0.05)，见表3、表4。

2.4 新辅助化疗对宫颈癌的临床疗效

对60例患者NACT后均行妇科检查，发现癌组织缩小1/3～1/2，其中无效9例，有效51例，总有效率为85.00%。

表3 PHD3与HIF-1及NF-κB在宫颈癌组织中表达的相关性比较(n)

Table 3 Comparison of the relationship between PHD3 and HIF-1 and that between PHD3 and NF-κB in cervical cancer(n)

2.5 新辅助化疗对宫颈癌组织中各指标表达的影响

对60例患者行NACT后，HIF-1和NF-κB表达比例均有所降低，PHD3的表达比例有所升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表5。

表4 HIF-1与NF-κB在宫颈癌组织中表达的相关性比较(n)

Table 4 Comparison of the relationship between expression of HIF-1 and NF-κB in cervical cancer(n)

2.6 新辅助化疗后各指标疗效情况

在60例宫颈癌组织中，PHD3、HIF-1和NF-κB表达阳性率与阴性率比较差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表6。

表6 宫颈癌组织中PHD3、HIF-1和NF-κB表达与新辅助化疗疗效关系[n(%)]

Table 6 Relationship of the expressions of PHD3, HIF-1 and NF-κB in cervical cancer tissues with the effect of neoadjuvant chemotherapy[n(%)]

3 讨论

3.1 新辅助化疗治疗宫颈癌的现状

大量研究表明，NACT显著提高了手术切除率，降低了宫旁浸润、淋巴结转移和脉管癌栓等发生的比例，患者5年生存率明显提高[2]。然而，还有部分患者对NACT不敏感，Marchiole等[3]研究显示，部分肿瘤大于2cm的宫颈癌患者NACT后肿瘤间质浸润仍大于3mm，这些患者被认为对NACT不敏感，且术后复发风险高。如果对这部分患者仍进行NACT治疗就会延误治疗时机，造成不必要的痛苦和浪费。

3.2 宫颈癌化疗敏感性及耐药的研究

以往对影响宫颈癌化疗敏感性多集中在一些临床病理参数及肿瘤细胞本身异质性的研究，如：组织学类型、肿瘤大小、治疗前血鳞状细胞癌抗原(SCC)和血红蛋白(Hb)水平、肿瘤细胞中各种因子(多药耐药基因、细胞周期相关蛋白、细胞增殖和调亡因子、与DNA损伤修复相关因子)的表达差异等；但迄今为止这些指标对于临床的指导意义和应用价值仍十分有限，尚不能较理想地预测肿瘤的耐药性及预后，这说明还有许多未知的耐药分子及机制有待进一步发现。

近来研究表明，除了肿瘤细胞本身的异质性外，肿瘤细胞所处的微环境也对肿瘤细胞治疗的反应性起重要作用。低氧可以促进肿瘤细胞的生长、浸润和转移，并诱导肿瘤细胞对化疗的抵抗。Kato等(2006年)研究发现，缺氧可诱导核转录因子—HIF-1表达增高，进而通过上调其靶基因多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1，mdr 1)编码的膜蛋白P糖蛋白(P-glycoprotein，P-Gp)及凋亡相关Bcl-2家族成员(Bcl-XL和Bax)的表达而引起耐药。PHD3是PHD家族的一员，PHD3可羟基化HIF-1分子中特定的脯氨酸，从而引起HIF-1的降解，并阻断因HIF-1集聚和活化而引起的与肿瘤新生血管形成、肿瘤周围组织侵犯及远处转移等有关的下游基因的表达[4]。Place等[5]报道，PHD3在肿瘤细胞上皮-间质转化当中明显下降，提示PHD3在肿瘤的复发转移中起到保护性作用。Su等[6]发现，PHD3在分化良好的肿瘤组织和肿瘤细胞系中表达增高，它可以通过HIF-1依赖和非依赖的途径诱导肿瘤细胞发生凋亡，起到抑制肿瘤生长和转移的作用。Rantanen等[7-8]使用结合于PHD3的羧基端加强型绿色荧光蛋白转染人宫颈腺癌Hela细胞，在保留其羧基化活性和充足供氧的情况下，PHD3能诱导蛋白水解酶聚集和导致caspase依赖的细胞凋亡，而PHD的抑制剂二甲基酸草基甘氨酸能抑制这一过程。

3.3 宫颈癌新辅助化疗前后脯氨酸羟基化酶3、缺氧诱导因子-1和核转录因子κB的表达

本研究60例行TP方案NACT的宫颈鳞癌患者，对化疗敏感者与不敏感者癌组织中PHD3的表达存在明显差异，提示PHD3基因可能是一个与宫颈癌NACT敏感性密切相关的基因。由于PHD3羟基化HIF-1分子中特定的脯氨酸可引起HIF-1的降解，而HIF-1的表达升高与多药耐药相关；另一方面，PHD3可抑制NF-κB信号通路，而NF-κB信号通路激活已证实在肿瘤耐药中起重要作用。因此推测PHD3可能通过促进HIF-1降解及抑制NF-κB信号通路而引起对药物敏感性的改变。本研究结果也印证了上述推测，但其具体机制尚待进一步研究。同时，本研究也发现PHD3的表达与肿瘤转移密切相关，PHD3高表达的患者，淋巴转移率低；显微镜下发现，HIF-1的表达主要存在于坏死区和肿瘤侵袭的边缘，这可能与肿瘤内部氧水平降低有关。此外，本研究中，有效组化疗后组织中HIF-1和NF-κB阳性率明显低于无效组，而PHD3的表达情况恰恰相反，换而言之，新辅助化疗前组织中HIF-1和NF-κB的表达水平影响着患者化疗疗效，即新辅助化疗前组织中HIF-1和NF-κB表达越高者，则患者对新辅助化疗越不敏感，临床疗效越差。通过检测新辅助化疗前组织中的NF-κB与HIF-1表达水平，可以作为判断宫颈癌新辅助化疗敏感度的重要指标之一。

本研究发现NACT的有效率达85.00%，与文献[9]报道的一致，提示NACT对于手术前宫颈癌患者有确切的临床疗效。肿瘤耐药是肿瘤细胞适应抗癌药物微环境的重要机制，实体肿瘤的低氧及多重耐药是近年的研究热点，但由于其机制的复杂性，目前尚无突破性结论。

目前，与PHD3、HIF-1和NF-κB相关的肿瘤治疗方法多处于基础研究阶段，极少部分应用于临床，相信随着对PHD3、HIF-1和NF-κB研究的不断深入，对研究宫颈癌的发病机制，判断肿瘤的耐药性、预后及治疗将有深远的意义。本研究虽然从某些方面证实PHD3、HIF-1及NF-κB在宫颈癌NACT前后有显著变化，但具体机制还有待进一步研究，对其在化疗耐药的作用也有待进一步验证。下一步拟完善对细胞耐药性效应的检测，分别转染psi-PHD3、pEGFP-PHD3的HeLa细胞株，未经基因操作的HeLa细胞株，比较不同PHD3表达水平下，用药后HIF-1与其相关底物分子mdr1、Bcl-XL和Bax的改变，进一步证实PHD3可通过抑制NF-κB通路而影响宫颈癌细胞对化疗敏感性，并探讨其机制。

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[专业责任编辑：张欣文]

Expressions of PHD3, HIF-1 and NF-κB before and after neoadjuvant chemotherapy in cervical cancer tissues and their significance

YANG Hai-tao1, LIN Yi2, ZHONG Hui-zhen2

(1.NingboPathologicalDiagnosisCenter,ZhejiangNingbo315000,China;2.NingboWomenandChildren’sHospital,ZhejiangNingbo315000,China)

Objective To investigate the expressions of prolyl hydroxylase 3 (PHD3), hypoxia inducible factor 1 (HIF-1) and nuclear factor-κB (NF-κB) before and after neoadjuvant chemotherapy (NACT) in cervical cancer tissues, and to explore their clinical significance in prediction of drug resistance and prognosis.Methods Sixty patients with cervical cancer were selected, and they underwent two courses of paclitaxel plus cisplatin chemotherapy. PHD3, HIF-1 and NF-κB were detected by SP immunohistochemical method in 60 patients before and after chemotherapy. Results PHD3 and NF-κB protein expressed in both cervical carcinoma and normal cervical tissues. HIF-1 did not expressed in normal cervical tissues, but it obviously expressed in cervical carcinoma. The expressions of PHD3 and NF-κB protein in normal cervical tissues were significantly lower than those in cancer tissues (χ2value was 5.372 and 4.521, respectively, bothP<0.05). The positive expressions of PHD3, HIF-1 and NF-κB were closely related to the pathological grading, clinical staging and lymph node metastasis, and the differences were significant (χ2value was 6.193, 4.463 and 11.854, respectively, allP<0.05). After chemotherapy, HIF-1 and NF-κB expressions in cervical cancer tissues decreased, but the expression of PHD3 increased with statistical significance (χ2value was 6.112 and 7.532, respectively, bothP<0.05). The difference in chemotherapy effective rate between patients with positive expressions of PHD3, HIF-1 and NF-κB and those with negative expressions of these three was significant (χ2value was 11.726 and 7.205, respectively, bothP<0.05).Conclusion PHD3, HIF-1 and NF-κB may be used as indexes to determine the invasion of cervical cancer and to prejudge the chemotherapy effect on the prognosis of cervical cancer.

cervical cancer；prolyl hydroxylase 3(PHD3)；hypoxia inducible factor 1(HIF-1)；nuclear factor-κB(NF-κB)

2014-08-21

宁波市科技局自然科学基金资助项目(2010A610048)

杨海涛(1974-)，男，副主任医师，主要从事妇科及乳腺科病理诊断工作。

钟惠珍，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.04.048

R737.33

A

1673-5293(2015)04-0797-03