骨骼肌来源干细胞治疗压力性尿失禁的研究进展

王文莉 综述 段 华 审校

(首都医科大学附属北京妇产医院妇科微创中心，北京 100006)



·文献综述·

骨骼肌来源干细胞治疗压力性尿失禁的研究进展

王文莉 综述 段 华*审校

(首都医科大学附属北京妇产医院妇科微创中心，北京 100006)

干细胞局部注射治疗压力性尿失禁(stress urinary incontinence, SUI)是一种新兴的微创疗法，干细胞不仅可以分裂融合为肌细胞并自我更新，还可以分泌各种生长因子，促进局部神经及肌肉组织再生，从解剖功能上修复括约肌功能障碍。本文就骨骼肌来源的干细胞治疗SUI的疗效及相关风险进行综述。

压力性尿失禁； 干细胞； 神经纤维

压力性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)是经完整的尿道不随意地遗尿，在大笑、咳嗽等增加腹内压的活动时即可引起排尿。世界上约35%的成年女性患有不同程度的SUI[1]。研究表明SUI患者的盆底肌及尿道平滑肌存在萎缩、变形等退行性变，盆底及尿道周围横纹肌松弛，尿道平滑肌张力减退，膀胱颈及尿道位置降低使尿道倾斜角增大，膀胱尿道后角消失，当膀胱内压增高时，尿道阻力不足以控制尿液而导致SUI的发生，严重影响患者的生活质量。随着社会进步、老龄化程度增高及人们对生活质量要求的不断提高，SUI的患病率、就诊率逐年上升[2，3]。目前，SUI的治疗方法多种多样，保守治疗风险较小，但远期效果欠佳，复发率高；手术疗效肯定但适应人群有限，且风险较大[4]。干细胞局部注射治疗作为一种SUI新兴的微创疗法[5]，不仅对盆底起填充作用，还能作为肌源性纤维的来源分裂融合为肌纤维，分泌各种生长因子，促进局部神经及肌肉组织再生，持久性强，重建盆底组织功能，从解剖功能上修复括约肌功能障碍[6]。尿道括约肌骨骼肌干细胞移植与Burch阴道壁悬吊术(Burch colposuspension)、经阴道无张力尿道中段吊带术(middle urethral tension-free vaginal tape, TVT)及经闭孔无张力尿道中段吊带术(transobturator tension-free vaginal tape, TOT)疗效的对比研究结果显示，干细胞组明显优于吊带植入组[6，7]。同时，自体干细胞还可作为载体将外源基因导入体内行基因治疗，为治愈SUI带来希望。本文就骨骼肌来源的干细胞治疗SUI的疗效及相关风险进行综述。

1 骨骼肌来源干细胞的基础研究

在早期胚胎、骨髓、脐带、胎盘和部分成年人细胞中均存在干细胞，具有无限自我复制、自我更新以及全能或多能分化能力，不同来源的干细胞分化潜能各异，在适当的条件下，可以分化成多种细胞系并形成各种具有明确功能的组织或器官，是形成器官和组织的基础细胞。目前，自体来源骨髓干细胞，脂肪源性干细胞，新生儿相关来源干细胞对患者来说承担的风险相对较大，手术复杂，且获得细胞数量较少，而骨骼肌来源的干细胞比较容易获取，可直接自活体取材，在局部麻醉下便可进行，具有取材方便，不影响活体组织和功能，免疫原性低和移植后存活时间长等优点。骨骼肌来源的干细胞根据其分子表型和生物活性的不同可分为肌源性干细胞(muscle derived stem cells, MDSCs)、肌卫星细胞和侧群(side populations，SP)细胞[8]。体外培养肌源性干细胞常被用作基因载体和组织工程方面的实验研究[9]。

1.1 肌卫星细胞

肌卫星细胞是最早发现的骨骼肌来源的干细胞，位于肌膜和基膜之间，为体积较小的扁平或立方形细胞；正常情况卫星细胞处于相对静止状态，静止期的肌卫星细胞不表达定向成肌细胞的标志，如：Myf5、MyoD、myogenin、Myf4、bcl-2提示卫星细胞与定向成肌细胞不同，它可能是多潜能干细胞。研究报道至少有两群卫星细胞存在于骨骼肌，且体内外的行为及特征均不相同[10]。在特定的损伤、变性、锻炼或牵拉等应激条件、微环境或调节因子作用下，促使静止期的肌卫星细胞可以被激活进入分裂、增殖期产生成肌前体细胞，原来广泛分布的肌卫星细胞向受损区迁移并被激活，进行有丝分裂，随后细胞之间相互融合或与受损肌纤维末端融合，融合后的细胞即开始合成收缩蛋白，并进一步分化、融合形成肌管，参与骨骼肌的修复。

1.2 MDSCs

MDSCs是从骨骼肌中分离出的一类成体多能干细胞,属于成体干细胞的一种，不属于间充质组织和肌源谱系，具有多细胞系分化和自我更新能力[11]。通过诱导刺激，MDSCs可以分化为脂肪、骨骼、软骨、平滑肌、神经和血液细胞等多种细胞和组织类型[12]。它表达干细胞的相关标记：Sca-1，bcl-2，CD34及肌细胞相关标记：desmin, myogenin等。MDSCs分为2类主要亚群，即CD45+MDSC和CD45-MDSC。从正常肌肉分离的CD45+MDSC在体内外实验中表现出非常有限的生肌潜力，但它们有高度的造血潜力。相反，CD45-MDSC 在体内外实验中容易分化为生肌细胞，并且也能分化为其他谱系细胞，如血细胞[13]。研究[13,14]显示MDSCs具有免疫豁免性，抗原性极低，移植试验中能避免如卫星细胞移植后早期死亡的问题，存活率更高，再生修复骨骼肌的能力比卫星细胞更强。目前，MDSCs与卫星细胞的关系尚未完全明确，以上事实似乎说明CD45-MDSCs是卫星细胞的前体细胞，向卫星细胞分化的同时逐渐获得卫星细胞表型标志。

1.3 SP细胞

Lin等[15,16]采用Hoechst染色肌细胞的荧光激活细胞分离术(fluorescence activated cell sorting, FACS)从骨髓中纯化造血干细胞，造血干细胞具有拒染荧光染料Hoechst33342的特性。随后，他们用相同的方法在骨骼肌中也分离到能够分化为各种血细胞的MDSCs，又叫SP细胞，这些SP细胞也具有拒染荧光染料Hoechst33342的特性，其特异的细胞表面抗原为CD33、CD133，且表达造血干细胞的表面抗原CD45[11]。卫星细胞在体外培养时融合为肌管，而SP细胞体外培养时却形成17,21-Hydroxyprogesterone克隆，提示两者不同[9]在活体，全身系统用药后SP细胞可以融合肌纤维，将SP细胞移入受损的肌肉中，SP细胞可进一步分化成Myf5+的生肌细胞[11]。Frank等[10]研究显示SP细胞高表达BMP4，BMP4可诱导其受体BMP 受体1a (BMPR1a)的增殖，促使SP细胞转化为肌细胞，MDSCs高表达其拮抗体Gremlin，而且在相同的诱导分化条件下，两者的增殖分化情况也截然不同，说明SP细胞和MDSCs是不同的细胞系，这些SP细胞已被包括脑、心、肺、脾、肾、小肠和骨骼肌在内的各种活体组织中证实。

2 SUI的骨骼肌干细胞治疗

盆底各种肌肉、韧带的正常功能对维持正常的排尿活动有重要作用，尿道括约肌是维持尿道正常功能的关键结构，正常情况下，腹压增加时，盆筋膜周围与盆筋膜腱弓相连的肛提肌收缩，拉紧尿道周围的组织——吊床结构，尿道被压扁，使尿道内压能有效抵抗升高的腹压而控制排尿；如果其支持结构的“吊床”被破坏，膀胱产生过度活动，腹压增加时，尿道不能闭合而增加抗力，就会发生SUI。传统的注射疗法是经尿道或经阴道将填充材料注入膀胱颈、尿道近段或中段的尿道旁组织中，使尿道腔缩小、变窄或拉长，以增加流出道的阻力，延长功能性尿道的长度，起到关闭尿道内口和后尿道的作用，但远期填充效果欠佳，易复发。干细胞尿道周围注射不仅能达到上述效果，而且远较其他材料持久性强，能改善盆底肌和尿道平滑肌收缩功能，增加盆底支持力和尿道平滑肌阻力，重建盆底组织功能；还能作为肌源性纤维的来源分裂融合为肌纤维，分泌各种生长因子，促进局部神经及肌肉组织再生，增加尿道黏膜和括约肌厚度的作用[17～19]，使尿道周围肌肉增生增加尿道阻力，改善下尿路肌肉本身的功能，从解剖功能上修复括约肌功能障碍[6,20]，疗效较注射无生物活性填充材料明显提高。

2.1 骨骼肌干细胞动物治疗模型

Chermansky等[20]报道注射MDSCs可修复受损的大鼠横纹肌尿道，将MDSCs注射到尿道周围，于2、4、6周后分别检测大鼠泄漏点压力(leak point pressure，LPP)，并行大鼠横纹肌免疫染色,结果显示注射的MDSCs被发现已整合到受损尿道的肌肉层,更重要的是，MDSCs注射组LPP[2周：(38.2±2.2)cm H2O，4周：(43.1±2.6)cm H2O，6周(51.5±0.9)cm H2O]较造模组LPP显著提高[2周：(17.2±1.4)cm H2O，4周：(26.9±1.9)cm H2O，6周：(25.5±1.3)cm H2O]，且不影响膀胱功能，恢复了损坏的括约肌的功能。Kwon等[21]采用大鼠SUI模型，比较3组不同细胞(MDSCs组，成纤维细胞组及二者混合组)尿道注射疗法的效果，虽然各组的短期LPP均明显升高，但在恢复尿道肌肉收缩功能方面MDSCs组(4.67±0.43)mN/mg明显优于成纤维细胞组(3.04 ±0.15)mN/mg。

不仅如此，骨骼肌干细胞移植后在体内微环境的作用下还可分化成其他类型细胞，还可促进组织神经再生[19]。Xu等[22]报道在阴部神经切断的大鼠中移植具有生物降解作用的纤维蛋白胶和MDSCs混合物，结果显示纤维蛋白胶促进移植的MDSCs修复，干细胞分泌神经生长因子(nerve growth factor，NGF)以促进神经的再生。Delo等[23]分别取2周，3、24个月的小鼠骨骼肌细胞进行体外培养，观察骨骼肌细胞生长与年龄的关系，结果显示骨骼肌细胞随着年龄的增加其功能会逐渐减退，体外培养的倍增时间分别为(41.2±6.7)h,(67.3±10.3)h，(88.1±18.9)h；各年龄组表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的细胞，收缩功能均高于同组VEGF阴性的干细胞，但差异无统计学意义。

2.2 自体骨骼肌干细胞治疗

Strasser等[17]报道42例女性SUI和21例男性SUI经尿道注射自体上臂骨骼肌干细胞和成纤维细胞，注射量为2.5 ml，随访12个月，39例女性和11例男性生活质量评分术前(51.38±10.36) 分，术后(104.06±6.839) 分(P<0.0001)，尿道和括约肌厚度术前(2.103±0.371)mm，术后(3.303±0.297)mm(P<0.0001)，括约肌收缩力术前(0.56±0.246) mm，术后(1.462±0.354) mm(P<0.0001)；与28例注射胶原蛋白的患者相比，术后患者生活质量评分(incontinence quality of life ,I-QOL)中位数明显提高[106.38 分vs. 99.43 分,P<0.0001]，括约肌收缩力中位数明显提高[1.57 mm vs. 1.24 mm,P=0.003]，治疗SUI更有效。 Mitterberger等[18]选择123例女性SUI超声引导下尿道黏膜下自体骨骼肌干细胞和成纤维细胞移植，平均随访1年，术后下列评分均有显著提高：I-QOL[中位数51分(27～70分)vs. 中位数108分(29～110分)，P<0.001]，尿道厚度[(3.5±0.8)mm vs. (4.9±0.9)mm，P<0.001]，尿道括约肌厚度[(2.1±0.3)mm vs. (3.4±0.4)mm，P<0.001]，尿流率[(21.6±9.1)ml/s vs.(25.2±8.1)ml/s,P<0.001]，逼尿肌压力[(36.6±25.7) cm H2O vs.(31.2±16.7)cm H2O，P<0.001]，静息时尿道闭合压 [(28.8±12.3) cm H2O vs.(40.5±15.8) cm H2O，P<0.001]，自主收缩尿道时尿道闭合压[(51.8±35.8) cm H2O vs.(78.1±56.2) cm H2O，P<0.001]；但最大残余尿无显著差异[(425.9±129.6)ml vs.(450.5±118.0)ml,P>0.05]。

Carr等[24]采用经尿道注射MDSCs(细胞数:18×106～22×106)治疗8例SUI，平均随访1年，其中3例在治疗1个月后退出随访，剩余5例治愈的中位数时间为10个月，其中2例在治疗后3～8个月尿垫重量较治疗前减轻50%，并在第1次注射后4～8个月接受了二次注射，1例治愈，至随访终止时未再出现尿失禁，5例治疗及随访期间均无严重的不良事件发生。Stangel-Wojcikiewicz等[25]报道16例SUI行MDSCs治疗，均在自体上臂肌肉活检分离出MDSCs(细胞分离后在体外扩增8～10周，细胞数0.6×106～25×106)，在内镜引导下经尿道注入尿道括约肌周围9、12、3点的位置，体外培养的自体MDSCs在相差显微镜下均呈现均匀的细长形态，免疫组化结蛋白(+)，另外，肌细胞生成素的mRNA和MYHC-2A蛋白在体外扩增的细胞中均可见表达；随访2年，75%患者生活质量评分显著改善(其中50%患者完全改善，25%患者部分改善)；患者肌肉活检及注射部位均无出血或感染，无形态变化及致瘤，无排尿障碍，尿潴留及尿路感染，无严重不良事件发生，这表明MDSCs治疗女性SUI的前景是令人鼓舞的。Carr等[26]报道对38例女性SUI行自体股四头肌来源的MDSCs注射治疗SUI，分为低剂量组(细胞数1×106,2×106,4×106,8×106或16×106)及高剂量组(细胞数32×106,64×106或128×106)，治疗1，3，6，12个月后24 h漏尿重量，尿失禁和生活质量评估结果：33例完成此研究，高剂量组与低剂量组相比，漏尿重量减轻超过50%[88.9%(8/9) vs. 61.5%(8/13)]，膀胱功能改善[77.8%(7/9) vs. 53.3%(8/15)]，3 d内漏尿≤2次[88.9%(8/9) vs. 33.3%(5/15)均有显著改善，差异有统计学意义。治疗相关的并发症多数为痛经，盆、腹腔疼痛，活检、穿刺部位瘀伤，感染，尿失禁加重，排尿困难等，其中盆、腹腔疼痛(10.5%,4/38)，活检和注射部位瘀伤(7.9%,3/38)发生率较高，无重大不良事件。几乎所有活检和注射手术相关的不良事件可通过临床治疗好转或痊愈[26，27]。

尽管干细胞的相关基础研究已取得长足进步，但在临床治疗中干细胞研究还面临诸多问题，如干细胞的起源及其最佳的分离纯化方法，如何保持干细胞的原始特征及可塑性条件下进行大量扩增，以获得临床治疗所要的细胞数量；对干细胞的分化机理也还不清楚，无法对其定向分化进行精确调控，其致瘤性，移植后的安全性需临床长期、大样本研究，相信随着干细胞研究的深入，将为盆底功能障碍疾病的治疗带来新的曙光。

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(修回日期：2015-04-08)

(责任编辑：李贺琼)

Progress on Treatment of Stress Urinary Incontinence with Skeletal Muscle-derived Stem Cells

WangWenli,DuanHua.

MinimallyInvasiveCenter,BeijingObstetricsandGynecologyHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100006,China

Correspondingauthor:DuanHua,E-mail:duanhua888@163.com

【Summary】 There are a variety of treatment methods for stress urinary incontinence (SUI). Surgery is effective but has high risks, only to adapt to the limited population. Conservative treatment has a high recurrence rate and poor long-term results. Local injection of stem cell has been proposed as a new minimally invasive therapy of SUI. Stem cells, with the ability to transform into muscle cell, secrete various growth factors, promote local nerve and muscle tissue regeneration, and repair sphincter dysfunction. This article reviewed on therapy of skeletal muscle-derived stem cells and the associated risks of treatment.

Stress urinary incontinence; Stem cells; Nerve fibers

R694+.54

A

1009-6604(2015)06-0563-04

10.3969/j.issn.1009-6604.2015.06.024

2014-08-04)

* 通讯作者：E-mail：duanhua888@163.com