老年黄斑变性的动物模型研究进展

【摘要】老年黄斑变性（AMD）是导致65岁以上人群视力下降的主要原因之一，国内外不少学者均致力于对AMD的研究。由于该病的复杂性，至今尚无满意的治疗方法，且临床标本来源困难，成为AMD研究的瓶颈，因此，合适的动物模型对新疗法的研究至关重要。本文对近年来用于AMD研究的动物模型进行综述，通过对各模型的利弊分析，为选择合适的动物模型进行AMD研究提供一定的帮助。

文献标识码：A

文章编号：1002-4379（2015）01-0062-04

DOI：10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2015.01.019

作者单位：南京中医药大学，南京210000

通讯作者：魏伟，

E-mail：13951776603@163.com

Research progress of animal models for age-related macular degeneration

XU Zhuqing，WEI Wei. Nanjing University of Tra-

ditional Chinese Medicine，Nanjing 210000，China

【Abstract】Age-related macular degeneration（AMD）is the leading cause of vision loss of those over the age of 65.Scholars at home and abroad are dedicated to the study of AMD. Because of the complexity of the disease，there are no satisfactory therapies. Accurate animal models of the disease could assist greatly in the development of new therapies. This article reviewed different experimental animal models of AMD used in recent studies．

【Key words】animal model; age-related macular degeneration

老年黄斑变性是一种随年龄增长而发病率逐渐上升的黄斑疾病。在中国，65岁以上人群AMD的患病率超过10% 〔1〕。AMD病理改变为黄斑区的光感受器、视网膜色素上皮（RPE）、Bruch膜以及脉络膜毛细血管随着年龄增长而发生的一系列改变，其标志性临床表现为玻璃膜疣的出现 〔2〕。临床上将AMD分为萎缩型（干性）与渗出型（湿性）两大类。渗出型AMD主要特点是有脉络膜新生血管（CNV）的形成。虽然目前治疗本病的手段多样，但存在疗效不确定、对眼组织造成损伤、治疗周期长、费用昂贵等缺点，且没有从根本上解决疾病对视力的影响，因此，合适的动物模型对新疗法的研究至关重要。

1　直接诱导的CNV动物模型

CNV是湿性AMD视力减退的主要原因，对其治疗亦多致力于消除CNV，因此AMD的相关研究多选择直接诱导的CNV动物模型。

1.1激光诱导的CNV模型

该模型在目前AMD的相关研究中很常用。其主要机制为通过激光选择性的破坏光感受器外节、RPE细胞、Bruch膜和脉络膜毛细血管，引起一系列损伤修复反应，继而形成新生血管。该方式诱导CNV发生率可高达70%，形成的新生血管复合物主要包括成纤维细胞、RPE细胞和血管内皮细胞，早期尚有少量炎细胞聚集，如中性粒细胞和巨噬细胞等 〔3〕。激光诱导CNV动物模型虽与人类CNV疾病有很多共同之处，但是该方式伴有视网膜的损伤,而在人类CNV形成中是不存在的。另外,其引起Bruch膜破裂的原因与人类CNV也有所不同。激光诱导CNV在大小鼠、猪、兔、猴等动物身上都有成功造模实验，目前常用的激光有氪、氩、二极管等，不同激光诱导CNV时要注意激光的波长、光斑、输出能量、曝光时间等，这些因素对模型建造的成功率都有一定的影响 〔4〕。

1.2碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的CNV模型

在兔视网膜下注射bFGF凝胶微粒诱导的CNV，发生率

高达83%，荧光渗漏可持续2~6周，具有重复性高、经济、操作简单等优点，且无视网膜下积液形成。然而此模型没有基底膜沉淀物、玻璃膜疣、RPE脱离和视网膜下出血等人类CNV的表现，且bFGF不稳定，体内半衰期短。近年来研究发现，bFGF不是CNV生成所必需的，体内的表达水平也不足以诱导CNV的发生 〔5〕。

1.3血管内皮生长因子（VEGF）诱导的CNV模型

在猴眼内注射载有VEGF基因的腺相关病毒（AAV-VEGF）后第5周可诱导出CNV,并持续表达20个月，4周时CNV的生成率最高，可达95%。玻璃体内注射AAV-VEGF会出现虹膜新生血管,视网膜下注射则仅在注射区域出现CNV。免疫组化结果显示玻璃体内注射较视网膜下注射后眼内液中VEGF表达量高。玻璃体内注射低剂量AAV-VEGF不会影响视网膜神经感觉层及脉络膜,高浓度可诱导出视网膜新生血管。而视网膜下注射低浓度AAV-VEGF则会出现CNV和黄斑囊样水肿（CME），高浓度也可诱导出视网膜新生血管，由此可见VEGF注射部位、作用的靶细胞及弥散程度均会对CNV的形成有影响 〔6〕。另有实验证明在猴视网膜下注射重组人VEGF凝胶微粒,可产生累及黄斑的局限性视网膜脱离。2~8周可观察到CNV的形成，且发生率高达95%。但模型不存在AMD相应视网膜变性，Bruch膜也无沉积物形成 〔7〕。

1.4视网膜下注射自体玻璃体诱导的CNV模型

将兔自身玻璃体注射入其视网膜下，不造成玻璃膜的损坏，在4~40周内视网膜下新生血管（SRN）的发生率为33%~ 57%，引起视网膜变性、视网膜下细胞增生及CNV生成。由于Bruch膜没有受到机械性损伤，形成的SRN在FFA下未观察到荧光素渗漏。通过组织学切片见到新生血管具有脉络膜毛细血管的特征，SRN可穿过Bruch膜进入视网膜下腔，视网膜神经感觉层发生变性，神经胶质细胞和RPE细胞增生，该模型是一种不造成玻璃膜破裂的新生血管造模方式 〔8〕。

1.5脂质过氧化物诱导CNV模型

白兔视网膜下注射亚油酸过氧化物（LHP），CNV发生率为46%。造影见荧光素渗漏明显，组织学可见RPE细胞吞噬、吞饮LHP，RPE肥大，RPE层下间隙电子致密物和残余小体增加。由于白兔RPE细胞没有色素，因而不易通过FFA分辨脉络膜毛细血管与CNV；部分模型因CNV面积较小，未显示渗漏。该模型为单次大剂量视网膜下注射LHP，与人长期暴露于LHP和其他氧化损伤分子的情况不符 〔9〕。

2　AMD相关候选基因修饰的AMD小鼠模型

研究证明AMD的病理过程涉及氧化应激、免疫炎症反应以及脂质和碳水化合物的代谢等。建立在分子遗传学以及分子流行病学的基础上，目前已选出多个AMD相关候选基因，随之多种AMD相关候选基因修饰的AMD小鼠模型相继建立。

2.1　单核细胞趋化蛋白-1（Ccl-2）或其受体（Ccr-2）敲除小鼠模型

巨噬细胞是清除补体及免疫复合物的主要细胞，其功能的缺失有利于补体和免疫复合物的堆积，这可能间接促进了AMD的形成。Ccl-2对单核细胞具有趋化活性，可激活单核细胞和巨噬细胞，并调控单核细胞和巨噬细胞的黏附分子和细胞因子的表达。研究显示在Ccl-2及Ccr-2敲除小鼠的体内均发现了类似人类AMD的病理改变，包括RPE内脂褐素的沉积、玻璃膜疣的产生、光感受器细胞的萎缩和CNV的产生。超过9月龄的Ccl-2 -/-小鼠体内可见类似玻璃膜疣的视网膜下沉积物，数量随着年龄的增长而增多，并逐渐表现出Bruch膜增厚及其内胶原及弹力层的断裂，RPE细胞内VEGF表达的上调，CNV的形成等类似于人类进展期的AMD。然而，作为一种免疫缺陷动物，此类小鼠的存活率以及成模率不甚理想 〔10〕。

2.2趋化因子受体1抗体基因敲除（Cx3crl -/-）小鼠模型

研究显示在12月龄Cx3crl -/-小鼠眼底可观察到大量视网膜变性，光感受器层明显变薄，并观察到了黄色结节样类玻璃膜疣沉积物，通过持续光照或激光诱导，Cx3crl -/-小鼠产生CNV的概率明显增高。实验证明在视网膜内，小胶质细胞（MCs）是Cx3crl的唯一寄存细胞，且所有的MCs均表达Cx3crl，因此该模型可用于MCs与AMD病理机制的相关性研究 〔11〕。

2.3 Ccl-2／趋化因子受体Cx3crl双基因敲除小鼠模型

Ccl-2 -/-小鼠与Cx3cr1 -/-小鼠杂交产生Ccl-2及 Cx3cr1双基因敲除小鼠模型。实验研究显示6周龄的小鼠模型即可观察到类玻璃膜疣的视网膜改变，并随着年龄的增长变大融合，一些会形成疤痕样萎缩灶；同时该模型还会出现RPE细胞异常和光感受器细胞的萎缩，15%的模型小鼠可观察到CNV的形成。此外，Ccl-2 -/- Cx3cr1 -/-小鼠RPE细胞中能检测到A2E的表达 〔12〕。该模型小鼠优点是出现AMD病理改变要早于其他AMD模型小鼠，然而此模型造模技术要求高，建模难度大且成本高。

2.4 ApoE基因缺失（ApoE-/-）小鼠模型

AMD发病的年龄，ApoE基因（AMD的保护基因），高脂、高胆固醇饮食是AMD的重要影响因素。有研究显示，对2月龄ApoE-/-小鼠进行高脂喂养4个月后出现小鼠光感受器细胞和RPE层细胞萎缩、排列紊乱，Bruch膜厚薄不均，胶原纤维分叉，分叉处可见玻璃膜疣 〔13〕。其作为AMD动物模型的优点在于建模过程整合了3个AMD相关的发病因素，符合AMD多因素致病的特点，较符合AMD自然病程。但其缺点为ApoE基因与脂代谢相关，此动物模型的饲养过程又需一段时间的高脂、高胆固醇饮食，罹患动脉粥样硬化导致的心血管疾病风险较高，结合模型本身的高龄因素，此动物模型的成模率不高。最近有研究发现甲基-CpG结合域蛋白2（MBD2）与ApoE双基因敲除小鼠，其玻璃膜的增厚明显低于ApoE-/-小鼠，由此可能从基因角度发现新的有效的AMD治疗方案 〔14〕。

2.5载脂蛋白Bl00（ApoBl00）转基因小鼠模型

ApoBl00是一种血浆载脂蛋白亚型，是肝脏合成和分泌甘油三酯的VLDL所必须的载脂蛋白，此种基因的突变可引起多种脂蛋白的代谢紊乱。实验研究发现，从12月龄的人ApoBl00转基因小鼠体内观察到了一系列早期AMD的病理表现。包括Bruch膜明显增厚及基底膜沉积物，RPE细胞的空泡形成，并且高脂饮食喂养该种小鼠可加剧这些病理表现 〔15〕。综合可见，人ApoBl00转基因小鼠可作为一种较理想的早期AMD动物模型，尤其适用于脂代谢相关的AMD研究。

2.6超氧化物歧化酶（SOD）基因修饰小鼠模型

SOD是一类分布于视网膜中的超氧自由基的消除剂，SOD-1则是其中在视网膜组织中含量最多的一种亚型，SOD-1基因的缺失会增强氧化应激反应对视网膜的损伤。实验研究显示在86%10月龄以上的Sod-1 -/-小鼠体内可发现类玻璃膜疣的视网膜沉积物，且10%的小鼠造影可发现CNV。进一步研究报道，5月龄的Sod-1 -/-小鼠在相当于室外阳光能量的白光照射下可诱导玻璃膜疣 〔16〕。由此可见，Sod基因修饰小鼠可作为理想干性AMD研究模型，尤其适用于氧化应激反应与AMD致病机制的研究。

2.7　血浆铜蓝蛋白（CP）/亚铁氧化酶（HP）双基因敲除小鼠模型

铁与氧化应激反应相关联，CP是一种铁氧化酶，调节细胞中铁的输出。研究显示缺乏CP功能的人，老龄时会出现玻璃膜疣和视网膜色素变性。小鼠缺乏CP功能也会出现视网膜变性，但由于另一铁氧化酶（HP）的存在，这种改变比较轻微。实验结果显示6到9月龄的CP和HP双基因敲除小鼠眼底观察到了与AMD类似的病理表现，包括RPE的肥大和色素减退，视网膜下沉积，光感受器萎缩，视网膜下新生血管。超过12月龄的小鼠眼底表现巨噬细胞的浸润视网膜自发荧光的增强以及更多的视网膜下沉积 〔17〕。但该模型小鼠存活率低，大部分低龄小鼠死于运动失调，影响了模型进一步研究。最近有研究显示，一种铁螯合剂（去铁铜）可减轻该模型视网膜的损伤 〔18〕。

2.8补体因子H（CFH）基因敲除小鼠模型

CFH功能的缺失会导致补体C3在肾小球基底膜沉积，最终可导致膜增生性肾小球肾炎（MPGN），有趣的是在这些病人眼底观察到了与AMD类似的玻璃膜疣形成。实验结果显示两岁的CFH -/-小鼠也发生了MPGN以及类AMD的视网膜病理改变。包括ERG显示a、b振幅均降低，视网膜自发荧光的增强，视网膜下沉积物的增多，光感受器外段的紊乱 〔19〕。补体C3的激活会增强β淀粉样蛋白（Aβ）在基底膜的积存，进一步实验研究发现淀粉样蛋白抗体可一定程度的降低CFH -/-小鼠的视网膜损伤 〔20〕。

2.9脑啡肽酶（NEP）基因敲除小鼠模型

有研究发现，Aβ特异性的沉积于AMD患者眼内，并与玻璃膜疣的形成相关，而NEP具有降解Aβ的作用，NEP基因敲除小鼠可增加Aβ的沉积。实验证明，27月龄的NEP基因敲除小鼠体内可发现Aβ沉积于RPE细胞层与Bruch膜之间，并可检测出VEGF的高表达，同时伴随色素上皮源性因子（PEDF）的低表达，符合氧化应激反应的表现 〔21〕。此外，视网膜下沉积以及RPE细胞的萎缩等类似早期AMD的病理改变也在模型体内发现。

3　其他AMD模型

3.1视网膜光损伤小鼠模型

AMD发病机制与长期低强度光损伤有关。实验研究发现，视网膜光损伤的发生部位与AMD近似，外层视网膜，尤其是光感受器外段最早受累。通过2000 Lux白色冷光源对大鼠进行24 h持续性照射后，ERG显示b波振幅下降至（80.986±26.286），为光照前的29.68%。电镜下光感受器外节膜肿胀模糊，排列紊乱，膜间隙较大，出现分离、崩解、空泡变性；内节线粒体肿胀，嵴端断裂，部分空泡变性；外核层大量核膜皱缩、内陷，染色质聚集、浓度不均，可见较多凋亡细胞。SOD活力明显降低，MDA和NO的含量明显升高 〔22〕。该模型存在建模方式简便快速的优势，但模型与人AMD的自然病程及病理表现还存在一定的差异。

3.2碘酸钠诱导非渗出型AMD模型

研究结果显示，予大鼠经舌下静脉分别注射30~40 mg/kg 的NaIO 3后，大鼠ERG显示各种波的振幅明显降低，眼底彩照显示注射NaIO 3后3天出现部分视网膜坏死，视网膜坏死程度与注射后时间及注射量呈正相关。平片显示，注射NaIO 3后3天单层RPE细胞出现坏死。体外实验发现，浓度30 mg/L NaIO 3组RPE-19细胞增殖率降低。实验证明NaIO 3诱导的PRE细胞凋亡受剂量和时间影响，剂量为30~40 mg/kg NaIO 3的模型适用于研究AMD的早期病理表现 〔23〕。

3.3聚乙二醇（PEG）诱导非渗出型AMD模型

实验研究结果表明，在小鼠视网膜下注射0.5 mg PEG400五天后，会诱导32%视网膜外核层的变薄，61%光化学感受器内外段长度的减少，49%外核层中心密度的降低，31%RPE密度增加。通过光电镜还可以观察到组织细胞凋亡的迹象以及变性的RPE细胞。基因组学观察发现注射后多个与AMD相关基因的高表达，例如补体C3，CFI，基质金属蛋白酶9，脂蛋白酯酶等。由此可见PEG诱导的模型具有非渗出性AMD形态学及基因表达双重相似性 〔24〕。此前有研究显示，在小鼠视网膜下注射1 mg具有更高聚合度的PEG8三天后，可以诱导出CNV，同时免疫组化结果可以检测出补体C3、C9，VEGF，转化生长因子β2及FGF等AMD相关因子的高表达 〔25〕。

3.4快速衰老（SAM）小鼠模型

SAM小鼠最初由日本京都大学在对AKR/J系小鼠进行常规近交系培育时意外发现的。小鼠在生命早期就出现了本该在老年期才出现的身体各部位功能衰老现象。该模型常用于老化相关实验研究。分为两类，呈现快速衰老易感的SAMP系以及呈现衰老抵抗型的SAMR系。实验研究发现在8月龄的SAMP8小鼠身上可观察到类AMD样改变，包括玻璃膜的增厚，RPE基底部层状及线样沉积，以及小范围的玻璃膜内新生血管形成 〔26〕。

总之，AMD模型各有其优缺点，相对好的模型存在造模技术要求较高，建模难度大且成本高等缺点，一定程度影响了AMD的研究。由于AMD涉及遗传及环境因素，虽然目前建立的AMD模型方法繁多，但尚无一种模型可以完全再现人AMD的发展过程，因而有必要进一步研究,以寻找更佳的AMD模型。