人角膜基质常温下氮气脱细胞法的初步研究

齐飞 张晓宇 李若溪

人角膜基质常温下氮气脱细胞法的初步研究

齐飞 张晓宇 李若溪

目的研究室温下对取自于角膜激光屈光手术削除的基质瓣进行无毒化脱细胞处理的方法。方法在无菌条件下收集激光屈光手术后废弃的人角膜基质瓣。角膜瓣冲洗2～3次后置于5 ml离心管中。将离心管充满氮气并封管,常温或4℃冰箱保存7 d。取出角膜瓣,再次冲洗2～3次后恒温震荡24 h,每隔1～2 h换液,得到脱细胞角膜基质瓣。对上述处理后的角膜基质瓣进行苏木精-伊红染色(HE染色)及Hoechst 33342染色以观察脱细胞效果。结果经上述处理获得的角膜基质瓣透明度良好,HE染色及Hoechst 33342染色未见明显基质细胞残留。结论本研究取材于角膜激光屈光手术削除的基质瓣,经过无毒化脱细胞处理,解决了角膜基质来源和脱细胞试剂毒性残留的问题,有较好的临床应用前景。

角膜；角膜基质；氮气；脱细胞

中国公民因单眼和双眼角膜病致盲的盲人约300～500万,仅次于白内障,居眼科致盲疾病的第二位。导致角膜盲的主要疾病包括各种感染性角膜病、角膜变性、严重机械外伤、眼表化学伤、重症干眼症等,几乎涵盖了所有角膜病种。其中大部分患者获得有用视力的唯一方法是手术治疗,而手术的主要方式是角膜全层或板层移植。我国由于受到传统观念和眼库条件的限制,角膜捐献者数量有限,治疗成本昂贵,并且部分角膜供体由于时间和空间的限制不能得到及时充分的利用,因此远远不能满足临床需求,给患者家庭和社会带来巨大压力。在角膜供体极为匮乏的情况下,利用细胞学和组织工程学手段获得具有正常生理结构和功能的角膜组织是使这些患者脱盲的关键技术。本研究针对眼科临床工作的这一重大现实问题,对角膜基质组织的去细胞技术进行了研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究中使用人角膜基质组织,来源于人眼经

过激光屈光手术切削除去的角膜基质瓣。

1.2 方法

1.2.1 角膜基质瓣预处理 用消毒的显微无齿镊将激光屈光手术中切削去的表面光滑、厚度40～140 μm、平均直径(8±2)mm的角膜基质瓣,自手术台上放入盛有含0.3wt％青链霉素的平衡盐溶液(以下称“洗涤液”)的1 ml规格的无菌eppendorf管中,转移至二级B2型生物安全柜,在培养皿中注入洗涤液,取出角膜基质瓣,并在培养皿中清洗2～3次,2～5 min/次。

1.2.2 去细胞过程 将角膜基质瓣放入5 ml离心管中,使用便携式氮气瓶将离心管中充满氮气,旋紧离心管管盖并用封管膜封管,常温或4℃保存5～7 d；之后在无菌条件下,取出角膜基质瓣,转移至二级B2型生物安全柜中,在培养皿中用洗涤液清洗2～3次,2～5 min/次,再在洗涤液中,在转速150～250 rpm条件下,15～25℃恒温震荡处理24～36 h(恒温震荡培养箱,Labnet公司,型号211DS),并且每隔1～2 h换洗涤液1次,即得到脱基质细胞的角膜基质。

1.3 病理学研究 对脱细胞的角膜基质瓣进行HE及Hoechst 33342染色,观察基质瓣微结构及有否细胞成分残留。

2 结果

通过本方法获得的角膜基质瓣透明度好,无明显细胞成分残留,基质组织结构接近正常角膜,未见明显纤维碎裂、溶解。

3 讨论

角膜表层组织包括角膜上皮层和部分基质层,其结构对维持眼表的生理功能和眼球的视觉功能具有十分重要的意义。角膜上皮目前已有多种重建方法并已应用于临床,取得了客观的治疗效果。而角膜基质层的材料来源和脱细胞处理方式虽有多种,但存在以下问题：①角膜基质材料来自于人眼或动物眼,人角膜组织相容性最好,但全层角膜来源匮乏,而来源于动物眼的角膜基质难以避免免疫反应等问题；②为尽量降低发生免疫反应的风险,用于角膜移植的角膜基质需提前对角膜基质上的基质细胞进行脱细胞处理。脱细胞处理方式由起初的传统冻融法发展至当今普遍应用的表面活性剂(即去污剂)洗脱法、液氮冻融法以及高静水压力法等,但均存在一些难以规避的问题：例如反复冻融［1］和高静水压力［2］处理均可能导致胶原断裂,损伤角膜基质的张力；而表面活性剂均具有较大的毒性,处理后难以应用于临床,目前多停留于实验室阶段。因此,寻找人角膜基质供体的可靠来源以及安全有效的脱细胞方法是具有重大临床实际意义的问题。

关于人角膜基质供体,激光屈光手术可能是非常理想的来源。现代激光屈光手术过程中取下的角膜基质透镜,厚度在40～140 μm左右,直径约8 mm,光学特性、大小和操作性均符合角膜板层移植手术的要求,以往手术后即被作为医疗垃圾处理。据粗略统计,我国每年激光屈光手术量＞50万例,且呈逐年增长的趋势,若充分利用角膜基质透镜治疗角膜盲患者,无疑是一盏为他们指路的明灯。

对角膜基质脱细胞方法的研究已有数十年,如前所述,既往多种脱细胞方法都因其局限性而难以在临床推广。近年来国内外角膜病领域的学者逐渐重视到这些局限性,开始探索如液氮冻融法等对角膜基质胶原损伤较小、毒性较低的方法。而本研究与现有技术相比,其优势在于：①全部流程中应用的药剂均无明显的毒性,可以最大程度保护角膜基质的生物学特性并有效地去除基质细胞。②易于操作,避免了反复冻融造成胶原断裂而损伤组织张力。③本方法中脱去细胞碎片时是在无菌平衡盐溶液进行恒温震荡的方式,能较好地保持人角膜基质内的电解质水平。

综上所述,人角膜常温氮气脱细胞法具有脱细胞完全、对角膜基质胶原无损伤、全部流程中应用的药剂均无毒性等优点,可最大程度保护角膜基质的生物学特性并有效地去除基质细胞。

［1］Shiro Amano,Naoki Shimomura,Seiichi Yokoo,et al. Decellularizing corneal stroma using N2 gas. Molecular Vision,2008(14):878-882.

［2］Sasaki S1,Funamoto S,Hashimoto Y,et al. In vivo evaluation of a novel scaffold for artificial corneas prepared by using ultrahigh hydrostatic pressure to decellularize porcine corneas. Mol Vis,2009,13(15):2022-2028.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.24.054

2015-07-21］

沈阳市科技计划(项目编号：F12-193-9-23),沈阳市科技计划(项目编号：F13-317-6-09)

110847 辽宁中医药大学(李若溪)；沈阳市第四人民医院(齐飞 张晓宇 李若溪)

李若溪