急性心肌梗死患者不同时期外周血LXA 4与CD 4+CD 25+CD 127-调节性T细胞水平及相关性研究

柳洪杰 刘鲁滨

1.北京市北安河社区卫生服务中心心血管内科，北京100095;2.北京大学医院内分泌科，北京100095

急性心肌梗死患者不同时期外周血LXA 4与CD 4+CD 25+CD 127-调节性T细胞水平及相关性研究

柳洪杰1刘鲁滨2

1.北京市北安河社区卫生服务中心心血管内科，北京100095;2.北京大学医院内分泌科，北京100095

目的通过检测急性心肌梗死患者不同时期外周血脂氧素A4(LXA4)与CD4+CD25+CD127-调节性T细胞(Treg)水平，研究LXA4在急性心肌梗死患者中的作用及机制，探讨其在此类疾病发病及预后中的作用。方法采用流式细胞分析法和酶联免疫吸附法(ELISA)，检测58例急性心肌梗死患者(AMI组)及30名健康体检者(对照组)入院及48 h后外周血LXA4、CD4+CD25+CD127-Treg细胞水平，并进行相关性分析。结果AMI患者入院时外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的百分率显著低于入院48 h及对照组(P＜0.05或P＜0.01);AMI患者入院48 h后的外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的百分率显著高于对照组(P＜0.01)。AMI患者入院时血浆LXA4水平显著高于48 h后及对照组(P＜0.01或P＜0.05);AMI患者入院48 h后血浆LXA4水平显著高于对照组(P＜0.01);AMI患者血浆LXA4水平与CD4+CD25+CD127-Treg细胞百分率呈显著负相关(r=-0.738，P=0.002)。结论CD4+CD25+CD127-Treg细胞及LXA4均在急性心肌梗死的发生发展中起到了重要的免疫调节作用，在心肌细胞缺血再灌注损伤中起到了保护细胞的作用。

急性心肌梗死;脂氧素A4;CD 4+CD 25+CD 127-调节性T细胞

冠心病的病理基础为冠状动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)及斑块形成。炎症机制在动脉粥样硬化斑块的发生、发展过程中扮演重要角色［1］。炎症细胞在不稳定斑块中积聚，释放高水平的炎症因子，诱导一系列的瀑布事件来放大免疫细胞浸润，导致斑块破裂，继而引起急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)。研究表明，调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)可能在动脉粥样硬化的发生发展中发挥了重要作用［2］。炎症的消退过程也和炎症的发生一样是个主动和程序化过程，内源性炎症消退机制成为近年来炎症研究的新热点［3］。近年来人们发现一类内源性化学介质，即特殊的促消退介质(specialized pro-re-solving mediators，SPM)，脂氧素(lipoxin，LX)是其中研究的比较多的一种内源性调节抗炎和促消退过程的关键介质［4］，其分子结构中有3个羟基和4个共轭双键，包括LXA和LXB两类。LXA4能降低炎性细胞因子的产生，抑制中性粒细胞的趋化与活化，是重要的调节炎症消退的抗炎介质［5］。本研究通过测定急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者不同时期外周血脂氧素A4(LXA4)与CD4+CD25+CD127+Treg细胞水平，研究LXA4在AMI患者中的作用及机制，探讨其在此类疾病发病及预后中的作用，从而为AMI治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选择2010～2014年于北京海淀医院住院的58例AMI患者(AMI组)，其中，男35例，女24例;平均年龄(56.23±12.18)岁。选择同期在北京海淀医院进行健康体检正常者(对照组)30名，其中，男19名，女性11名，平均年龄(58.61±10.14)岁。AMI患者均结合临床行心肌酶、肌钙蛋白Ⅰ等生化标志物及冠状动脉造影检查确诊。心肌梗死依据WHO诊断标准:①典型胸痛症状持续＞30 min;②特征性心电图变化;③心肌酶谱异常且有动态变化;3项中具有2项即可认定。所有确诊患者都采取相似的基础药物治疗方案:阿司匹林、氯吡格雷、硝酸酯类、血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、利尿剂、β受体阻滞剂、钙拮抗剂、他汀类药物等。排除标准:①严重心力衰竭、心肌病、心肌炎、心内膜炎、先天性心脏病等其他心脏病;②风湿性、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病或使用免疫抑制剂(如皮质类固醇);③恶性肿瘤;④妊娠;⑤急、慢性感染，炎症性疾病;⑥糖尿病、甲状腺功能亢进症或其他内分泌疾病，近期使用过影响免疫反应的药物;⑦近期重大外伤及外科手术、近期消化道出血、出血性疾病、贫血者;⑧周围血管疾病或周围血管栓塞性疾病、脑卒中;⑨严重肝肾功能不全。所有患者均签署了知情同意书。同时，剔除住院期间出现心力衰竭、心源性休克、再发心肌梗死、伴血流动力学障碍的心律失常、伴有心电图缺血证据的心绞痛、心源性死亡等情况。两组性别、年龄等一般情况比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 仪器与试剂

FC500型流式细胞仪为美国贝克曼库尔特有限公司产品。主要试剂:人Treg染色试剂盒;异硫氰荧光素(FITC)标记的鼠抗人单克隆抗体CD4 mAb(抗CD4 mAb)，规格100t;藻青蛋白-花青苷(PC5)标记的鼠抗人单克隆抗体CD25 mAb(抗CD25 mAb)，规格100t;藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人单克隆抗体CD127 mAb(抗CD127 mAb)规格100t;购于美国eBioscienee公司。LXA4试剂盒购自美国A&D公司。

1.3 检测方法

分别采集AMI患者入院时及48 h后清晨空腹静脉血两管，共5～8 mL(每管3～4 mL)。同时抽取对照组空腹静脉血。LXA4测定:肝素抗凝，30min内常规离心，分离血清，血清标本冻存于-80℃超低温冰箱待测。采用酶联免疫吸附法的夹心法严格按照试剂说明书检测。CD4+CD25+CD127-Treg表达率测定:EDTA抗凝，使用直接免疫荧光标记法标记细胞并进行流式细胞仪分析。操作步骤:取单克隆抗体CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE及同型对照各20μL，加入100μL EDTA抗凝的外周血，室温下避光孵育15 min，再加入红细胞裂解液500μL，避光孵育10min;加入PBS洗2次，1500 r/min离心5 min，弃上清后加入适量PBS。流式细胞仪检测并计算CD4+CD25+CD127-Treg细胞百分率。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差()表示，两组间比较采用t检验;两个正态分布的连续变量间相关关系采用Pearson相关分析;以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AM I患者入院不同时期及对照组外周血CD 4+CD25+CD 127-Treg细胞占CD4+CD 25+T细胞的百分率及比较

AMI患者入院时外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的百分率为(0.836±0.427)%，入院48 h后的外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的百分率为(6.752±2.854)%，对照组外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的百分率为(2.443±1.042)%。AMI患者入院时外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的百分率显著低于入院48 h及对照组(P＜0.05或P＜0.01);AMI患者入院48 h后的外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的百分率显著高于对照组(P＜0.01)。

2.2 AM I患者入院不同时期及对照组血浆LXA4水平及比较

AMI患者入院时外周血LXA4浓度为(32.851± 12.639)μg/L，入院48h后的外周血LXA4浓度为(16.471± 9.527)μg/L，对照组LXA4浓度为(7.142±5.918)μg/L。AMI患者入院时血浆LXA4水平显著高于入院48 h后及对照组(P＜0.05或P＜0.01);AMI患者入院48 h后血浆LXA4水平显著高于对照组(P＜0.01)。

2.3 相关性分析

AMI患者血浆LXA4水平与CD4+CD25+CD127-Treg细胞百分率呈显著负相关(r=-0.738，P=0.002)。

3 讨论

AS是一种炎症性疾病，炎症及免疫反应在AS的发生发展过程中起重要作用。AS斑块形成是内皮细胞损伤后炎性反应的结果，机体存在精密地调节炎性反应的机制［6］。在冠状动脉粥样硬化中炎症的激活不仅存在于血管病变，也包括活化外周血中的免疫细胞(中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)，尤其在AMI中不同的T细胞亚群在动脉粥样硬化的进展中起着不同的作用［7］。CD4+CD25+Treg是一个具有独特免疫调节功能的T细胞亚群，具有免疫抑制功能，它能通过分泌细胞因子及一系列信号通路介导免疫调节功能，在维持机体免疫平衡中起着重要作用［8］。LX是Serh在1984年发现的，是二十烷类家族中一类花生四烯酸的代谢产物，其分子结构中有3个羟基和4个共轭双键，包括LXA和LXB两类。LXA4在感染、损伤和炎症等过程中经跨细胞途径，由不同脂加氧酶(lipoxy genase，LO)顺序催化花生四烯酸(arach idonic acid，AA)而合成。LXA4是脂加氧酶相互作用的产物，能降低炎症细胞因子的产生，抑制中性粒细胞的趋化与活化，是重要的调节炎症消退的抗炎介质［9］。

AMI患者存在一种炎症的高敏状态，AMI患者炎症通路的激活包括冠脉病变以及循环中的淋巴细胞比例改变，CD4+CD25+T细胞是其中最主要的一群。Foxp3是CD4+CD25+T细胞内具有特征的标志物，但是Foxp3定位在细胞内且检测过程复杂。近期发现，CD127(IL-7受体)与Foxp3的表达呈负相关，因此在CD4+CD25+基础上联合CD127抗原的检测，能够很好地识别人CD4+CD25+T细胞［10］。本研究通过测定AMI患者不同时期外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的百分率并与对照组进行分析比较，发现AMI患者入院时外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的百分率显著低于入院48 h及对照组，入院48 h后的外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的百分率显著高于对照组。提示CD4+CD25+CD127-Treg细胞在AMT发生后数量显著增加，可能在AMI急性期炎症的消退及斑块的稳定中起到了积极作用。

LX分子中包含着典型的三羟基和四共轭双键结构，根据分子中羟基位置和构象的不同可分为四种: LXA4、LXB4、15-epi-LXA4和15-epi-LXB4［11］。人类LXA4受体(ALX)包括FPR1、FPRL-1/ALXR和FPR3三种，表达在各种白细胞上，如:中性粒细胞、单核巨噬细胞、激活的T细胞、星形胶质细胞［12］等。研究表明，LXA4一方面通过下调趋化因子和黏附分子的表达抑制中性粒细胞趋化、黏附和渗出，显著减轻炎症部位中性粒细胞的浸润;另外一方面，LXA4还能抑制中性粒细胞的活性，包括抑制炎性刺激引起的中性粒细胞中活性氧的产生及炎性细胞因子的表达［13］。此外，LXA4可促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞，有效地避免凋亡中性粒细胞发生继发性坏死以致炎性细胞内容物的释放，以及抑制促炎症细胞因子，如TNF-α、IL-1等的表达。LXA4被认为是机体内最重要的促炎症消退介质。中性粒细胞的聚集和活化是心肌再灌注中炎症损伤的主要因素之一，活化的中性粒细胞释放各种细胞因子和活性氧，进一步加重和损伤心肌组织。一些针对中性粒细胞和细胞因子的治疗也被证实可以减轻心肌再灌注损伤。本研究发现，AMI患者入院时血浆LXA4水平显著高于入院48 h后及对照组，入院48 h后血浆LXA4水平显著高于对照组。AMI患者血浆LXA4水平与CD4+CD25+CD127-Treg细胞百分率呈显著负相关。提示CD4+CD25+CD127-Treg细胞及LXA4在AMI中均起到了炎症消退调节作用。

AMI死亡患者尸检中发现，其心肌组织存在炎性浸润，提示AMI与炎症因子密切相关。目前可以明确的是AMI可以引起炎性反应，从而导致组织坏死和炎症细胞浸润。炎症因子在炎性反应过程中释放入血，其在血中的浓度可以反映机体炎症的程度与阶段。多种炎症因子在AMI后的变化及其对转归的影响是目前研究的热点。本研究显示，CD4+CD25+CD127-Treg细胞及LXA4均在AMI的发生发展中起到了重要的免疫调节作用，在心肌细胞缺血再灌注损伤中起到了保护细胞的作用，但具体机制及作用通路尚需进一步研究。

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Serum LXA4 and CD4+CD25+CD127-regulatory T cell levels of patients with acute myocardial infarction in different stages and its correlation analysis

LIU Hongjie1LIU Lubin2

1.Department of Cardiovascular Internal Medicine,Beijing Bei＇anhe Community Health Service Center,Beijing 100095,China;2.Department of Endocrine,Peking University Hospital,Beijing 100095,China

ObjectiveTo assay the serum LXA4 and CD4+CD25+CD127-regulatory T cells(Treg)levels of patients with acute myocardial infarction(AMI)in different stages,study the function and mechanism of LXA4 in patients with AMI, discuss its effect in the pathogenesis and prognosis of AMI.MethodsFlow cytometry and enzyme-linked immunosorbent analysis(ELISA).Methodswere used to detect the level of LXA4 and CD4+CD25+CD127-Treg in 58 patients with AMI(AMI group)at the moment of the admission and 48 hours after admission.At the same time 30 cases of normal controls(control gorup)were detected.Then the results were compared.ResultsThe percentage of CD4+CD25+CD127-Treg cells of CD4+CD25+T cells in the AMI patients at admission was significantly lower than the percentage of 48 hours after admission and the control group(P＜0.05 or P＜0.01).The percentage of CD4+CD25+CD127-Treg cells of CD4+CD25+T cells in AMI patients 48 hours after admission was significantly higher than control group(P＜0.01).The concentration of LXA4 in the AMI patients at admission was significantly higher than the percentage of 48 hours after admission and the control group(P＜0.01 or P＜0.05).The concentration of LXA4 in the AMI patients 48 hours after admission was significantly higher than the control group(P＜0.01).There was negative correlation between the concentration of LXA4 and the percentage of CD4+CD25+CD127-Treg cells(r=-0.738,P=0.002).ConclusionCD4+CD25+CD127-Treg cells and LXA4 play important roles in immune regulation in the occurrence and the development of AMI patients,and has effect of protection in ischemia-reperfusion injury of myocardial cells.

Acute myocardial infarction;Lipid oxygen element A4;CD4+CD25+CD127-regulatory T cells

R542.22

A

1673-7210(2015)03(a)-0042-04

2014-12-02本文编辑:程铭)