癫狂梦醒汤对兔动脉粥样硬化血管基质金属蛋白酶－9表达的影响

韩凤丽，于铭权

基质金属蛋白酶－9（MMP－9）能够分解血管平滑肌细胞（VSMC）基膜基质，将SMC 从基膜中释放出来，从而引起VSMC 的移行，在动脉粥样硬化（AS）发生和发展过程中起着十分重要的作用［1］。对AS 来说，血管内皮细胞的损伤及血脂代谢异常是其发生的重要始动因素。本实验通过喂饲高脂饲料的方法，建立兔AS模型，应用癫狂梦醒汤进行干预治疗，观察其对动脉内膜厚度、MMP－9表达的影响，以期为癫狂梦醒汤抗AS提供进一步的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及饲料 健康日本大耳白兔32只，均为雄性，体重（2～2.5）kg（辽宁医学院实验动物中心提供）。高脂饲料：1%胆固醇，8%熟猪油和91%的普通饲料。

1.2 药物、试剂、仪器 癫狂梦醒汤方剂由辽宁医学院附属一院中药局提供。兔抗人MMP－9多克隆抗体（上海太阳生物有限公司），胆固醇粉（安徽科宝生物工程有限公司）。CIAS－1000细胞图像分析系统（北京大恒图像视觉有限公司）、LEICA－RM－2135石蜡切片机（德国）。

1.3 方法

1.3.1 药物（癫狂梦醒汤方）制作 原方药物：桃仁24g，柴胡9g，香附6g，木通9g，赤芍9g，半夏6g，腹皮9g，青皮6g，陈皮9g，桑皮9g，苏子12g，甘草15g。在药学实验室浸泡、煎煮、去渣，每付中药浓缩至100mL，浓度为1.2g／mL（含生药量）。根据人体－家兔体表面积比值法换算家兔的每日用药量［2］：低剂量组3.1mL／（kg·d）相当于含生药量3.8g／（kg·d），高 剂量组4.7mL／（kg·d）相当于含生药量5.7 g／（kg·d）。中药高剂量为临床上每日1剂中药为标准，中药低剂量为临床上每1.5 日一剂中药为标准。4℃冰箱冷藏保存备用。

1.3.2 分组

1.3.2.1 试验分组 日本大耳白兔单笼饲养，室温20℃～22℃，相对湿度为50%～60%，自由饮食水。经适应性喂养1周后开始试验：遵循随机原则，将动物分成4组（A 空白对照组、B 模型组、C 癫狂梦醒汤低剂量组、D 癫狂梦醒汤高剂量组），每组8只。

1.3.2.2 模型制作［3］实验开始后，空白对照组继续喂饲普通饲料140（g·d）只＋蒸馏水5 ml／kg灌胃；模型组开始喂饲高脂饲料140g／d＋蒸馏水5 ml／kg灌胃；低剂量癫狂梦醒汤组喂饲高脂饲料140g／d＋癫方3.1mL／（kg·d）＋蒸馏水1.9mL／kg灌胃；高剂量癫狂梦醒汤组喂饲高脂饲料140g／d＋癫方4.7mL／（kg·d）＋蒸馏水0.3 mL／kg灌胃；自由饮水，喂养至第12周末。

1.3.3 标本留取 实验动物于第12周末采用颈动脉割伤法处死。迅速剖开腹腔，分离腹主动脉，剥除外膜结缔组织及脂肪，取1cm 动脉血管，冲净，放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色及免疫组化检测。

1.3.4 病理形态学 将兔主动脉标本于4%中性甲醛溶液固定24h之后，自来水冲洗4h～6h，逐级脱水、透明、浸蜡、包埋制成蜡块，用石蜡切片机进行连续切片厚度5μm，于45℃温水中展片，分别用普通玻片和多聚赖氨酸防脱玻片，捞片后置于56℃温箱中干燥2h～3h，用于HE 染色及免疫组化染色。每一标本取3张切片（普通玻片）作HE 染色；每一标本取3张切片（防脱玻片）作免疫组化染色，均按试剂盒步骤进行操作，免疫组化以细胞浆染色为主，测定其平均灰度值。

1.3.5 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差表示，4组间比较采用单因素方差分析（ANVOA），组间两两比较用LSD（方差齐）或DunnettT3（方差不齐）法进行显著性检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组内膜厚度测定 光镜下测定，正常组内膜厚度5.03μm±0.80μm，模型组269.07μm±37.42 μm，中药低剂量组72.10μm±6.39μm，中药高剂量组43.50μm±5.39μm。癫狂梦醒汤组内膜厚度明显低于模型组（P＜0.01）；高剂量癫狂梦醒汤组内膜厚度低于低剂量癫狂梦醒汤组（P＜0.05）。

2.2 对MMP－9蛋白表达的影响 免疫组化示：棕色反应物位于胞浆。正常对照组血管壁表达的少；模型组表达明显增多，内膜靠近中膜处尤甚，呈棕黄色或棕褐色，融合成片，与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，癫狂梦醒汤组表达明显减轻（P＜0.01）；与低剂量癫狂梦醒汤组比较，高剂量癫狂梦醒汤组表达降低（P＜0.01）。灰度值；正常组13.32±3.85，模型组74.58±6.78，中药低剂量组45.74±6.51，中药高剂量组33.52±3.64。

3 讨 论

中医并没有AS一词，中医将AS形成的首要因素高脂血症等归属为痰浊，将血液的高凝状态、血管壁受损、脂斑形成等视为血瘀。由于脏腑功能失调，气、血、津液运行、代谢障碍，导致痰浊内生，无形之痰浊留而不去，致血行不畅，瘀血阻滞，痰瘀交阻，这种病理状态持续发展下去，痰借血体，血借痰凝，痰瘀互结，着于血脉，血脉上凝着痰瘀结块使脉管本身受损，局部气血的运行和温煦受阻，日久胶结不解，凝之愈坚，这种痰浊瘀血相凝之结块即是AS斑块［4］。近年来在大量的临床及实验研究中，众多医家采用活血化痰中药防治AS，均取得了良好的治疗效果，也进一步证实了痰瘀互结是AS的主要病理机制。痰瘀互结是AS的基本病机，那么选用化痰降浊、活血化瘀法则是治疗AS的关键之所在［5］。因此，选择名方癫狂梦醒汤进行研究。方中桃仁、赤芍活血化瘀；柴胡、香附、青皮、陈皮、半夏理气化痰；苏子、桑皮、腹皮降气化痰；木通通利血脉；甘草调和诸药。诸药相合共奏豁痰化瘀利窍之功。

MMP 是降解细胞外基质的主要酶类，可为SMC从中 膜 迁 移 至 内 膜 扫 清 道 路［6］。其 中MMP－9 是MMP家族中的重要成员，主要功能是降解Ⅳ型胶原和弹力纤维，在基质降解、VSMC 迁移、AS 形成以及促进斑块破裂上起重要作用［7］。另外有研究表明，MMP－9可通过激活肝素酶参与SMC 从收缩型向合成型转换的过程［8］。

本实验观察到，模型组MMP－9蛋白表达较正常对照组显著增高，内膜靠近中膜处尤甚，呈棕黄色或棕褐色，融合成片，主动脉内膜明显增厚，提示在AS 中MMP－9蛋白表达显著增高；与模型组比较，癫狂梦醒汤可呈剂量依赖性的降低MMP－9表达水平，减轻动脉内膜增厚，提示癫狂梦醒汤可能通过抑制SMC从中膜向内膜下迁移，进而抑制AS形成。此结果与以往研究的系统给予MMP－9抑制剂［9］，早期可抑制AS形成的结果相同。

癫狂梦醒汤能够通过降低MMP－9的蛋白表达，减轻主动脉内膜增厚，而起到防治AS的作用。表明癫狂梦醒汤抗AS疗效可靠，为临床应用癫狂梦醒汤防止AS提供理论依据。然而AS的病理机制是多方面的，癫狂梦醒汤是否也可以通过其他途径和环节来达到防治AS的作用，尚有待于进一步研究。

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