抗Mtb免疫信号通路环鸟苷酸-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激蛋白的研究进展

刘春法 岳瑞超 赵德明 周向梅



·综述·

抗Mtb免疫信号通路环鸟苷酸-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激蛋白的研究进展

刘春法 岳瑞超 赵德明 周向梅

Mtb作为一种胞内寄生菌，细胞内如何识别其产物并启动固有免疫反应对Mtb的控制具有重要意义。干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes，STING)是天然免疫反应信号通路中重要的衔接分子，Mtb感染过程中STING-TANK 结合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK-1)-干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF-3)信号通路在介导Ⅰ型干扰素表达及诱导吞噬细胞自噬过程中发挥重要作用。最近的研究表明，环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)参与Mtb诱导的天然免疫反应，Mtb通过早期分泌抗原靶蛋白-6系统1(ESAT-6 system 1，ESX-1)分泌系统介导的细菌DNA释放，从而激活cGAS-STING通路。笔者将对该信号通路在Mtb感染过程中发挥作用的机制及相关研究进行综述，以期增强我们对结核病的病理过程和机体免疫机制的理解，为更好地开拓新的抗结核药物提供新的思路。

结核分枝杆菌/免疫学； 干扰素类； 核苷酸基转移酶类； 信号传导； 免疫, 先天

Mtb是引起人类及动物结核病的病原菌，是一种曾经引起人类恐慌的至今仍旧会每年造成数百万人死亡，以及对畜牧养殖造成重大经济损失的古老的微生物。在多年的进化过程中，尽管宿主对Mtb的识别机制多样[1]，但其具备了多种逃逸宿主杀菌机制的能力。Mtb与宿主的相互作用机制异常复杂，其中包括分枝杆菌毒力因子，以及控制疾病感染和病情发展的固有免疫和适应性免疫过程。在宿主与Mtb相互作用的过程中，肺部的巨噬细胞发挥了重大的作用，病原进入肺脏组织后巨噬细胞最先将其吞噬并形成吞噬体小泡。但遗憾的是，该过程并不能将Mtb杀灭清除[2]。

最初研究认为，Mtb通过抑制吞噬体与溶酶体的融合，以及抑制吞噬溶酶体的酸化在吞噬泡内存活并繁殖。但在Mtb感染过程中Ⅰ型干扰素的分泌及Nod样受体蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)和干扰素诱导蛋白2(absent in melanoma 2，AIM2)炎症复合体的激活，表明Mtb可激活胞质内的免疫机制。在2007年van der Wel 等[3]通过电子显微镜发现，人单核细胞源树突状细胞和巨噬细胞感染Mtb或海洋分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)2 d后出现了细菌从吞噬体到胞质的现象。最近的一项研究发现不仅在体外吞噬细胞内存在分枝杆菌从吞噬体破坏从而接触到胞质的现象，小鼠体内实验也验证在脾脏和肺脏中同样也可见Mtb释放到胞质，该研究还发现吞噬体膜的破坏在感染分枝杆菌后3 h就会出现，并且这种吞噬体膜的破坏与吞噬体内酸化抑制有关[4]。这些研究打破了我们对Mtb作为一种胞内寄生菌应该在吞噬体内存活和增殖的认识。

最近有研究表明，Mtb早期分泌抗原靶蛋白-6系统1(ESAT-6 system 1，ESX-1)分泌系统介导的细菌双链DNA的释放能够引起的一系列固有免疫反应，其中包括Mtb诱导的自噬的激活及干扰素(IFN)-β的产生[5-6]。这些固有免疫反应机制的激活与IFN基因的刺激因子干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes，STING)有关，但STING并不能够直接识别双链DNA(dsDNA)。因此，几乎同时有3篇相关研究发现在Mtb感染过程中环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)作为SITNG的上游信号，在识别Mtb释放到胞质的物质、诱导Ⅰ型干扰素、激发宿主固有免疫过程中具有重要作用[7-9]。该信号通路的研究增强了我们对Mtb与宿主相互作用之间的认识，为Mtb病理及疫苗研究带来了新的问题和挑战。下面笔者将对这一前沿研究成果加以综述。

cGAS识别Mtb产物

cGAS(也称C6orf150或MB21D1)是核苷酸转移酶家族成员，能够广泛特异性识别细胞质内的dsDNA。其蛋白结构与特异性识别胞质内dsRNA的2′-5′-寡腺苷酸合成酶(OAS1)高度相似，但cGAS含有一个能够识别B型dsDNA的锌囊结构[10]。在许多病毒感染，比如单纯疱疹病毒1型、牛痘病毒和人类免疫缺陷病毒感染时，cGAS在Ⅰ型干扰素及其他细胞因子的产生过程中发挥着重要的作用[11-13]。当DNA与cGAS结合后cGAS被激活，产生内源性第二信使环腺苷酸-磷酸鸟苷(cyclic GMP-AMP，cGAMP)，结合并激活内质网蛋白STING，进一步激活蛋白激酶IκB激酶(IKK)和TANK 结合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK-1)。然后IKK和TBK-1进一步刺激核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)和干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF-3)向胞核转运，从而诱导Ⅰ型干扰素和其他细胞因子的产生[14-16]。

Mtb感染的巨噬细胞中cGAS的转录水平明显升高，同时在结核病患者的损伤病灶中通过免疫组织化学检查也发现cGAS蛋白表达量的上调[9]。cGAS的缺失使Mtb感染诱导的IFN-β表达量降低[7-9]，这充分说明cGAS在Mtb感染过程中诱导Ⅰ型干扰素表达的作用。Mtb在胞质内是如何被识别，首先通过比较Mtb和ESX-1缺失的疫苗株BCG发现，BCG不能够诱导产生干扰素诱导蛋白10(interferon-inducible protein-10，IP-10)，进一步比较H37Rv和H37Ra两毒株之间诱导IP-10及其他细胞因子的差异，结果显示H37Ra引起的IP-10表达明显减弱，从而确定ESXA这一主要的ESX-1基质在激活胞质内DNA识别过程中的关键作用。另外，该研究还比较了ESX-1相关的白细胞介素(IL)-1β的表达，结果显示影响Ⅰ型干扰素表达的ESXA并不会对IL-1β的表达产生影响[10]。Mtb感染后cGAS会不会被激活产生cGAMP从而引起下游的免疫反应，该研究首先检测了Mtb感染后cGAMP的产生，通过cGAS敲除鼠与正常组对照显示了Mtb感染过程中会刺激cGAS产生cGAMP[10]。进一步研究cGAMP在STING激活中的作用，通过Mtb感染cGAS缺失和cGAMP合成抑制的细胞，单独感染不会引起Ⅰ型干扰素表达，感染后将两种细胞混合培养则重新出现了Ⅰ型干扰素的表达。这不仅说明cGAMP在Mtb诱导cGAS信号通路中的关键作用，也说明合成的cGAMP可以通过旁分泌的方式刺激静息状态下的细胞，使其产生Ⅰ型干扰素。

激活STING信号通路诱导Ⅰ型干扰素的表达

STING(又称为MPYS/MITA/ERIS)蛋白在2008年被3个独立的课题组先后报道，它是一个多功能衔接子，介导dsDNA诱导Ⅰ型干扰素产生。未受刺激的状态下STING蛋白主要定位于内质网上，也有部分在线粒体上，当受到cGAMP或环二鸟苷酸(c-di-GMP)的刺激后其构型发生变化招募TBK-1，并快速地从内质网转移到高尔基体，最终与TBK-1在细胞质组装，磷酸化IRF3并向核内转移，最终产生Ⅰ型干扰素，从而发挥抗病毒作用[17]。缺乏STING的细胞在感染Ⅰ型单纯疱疹病毒或者李斯特单胞菌时产生的IFN-β和其他促炎因子急剧减少[18-19]。尽管STING并不能够直接识别dsDNA，但由于多数dsDNA识别受体的存在，来源于细菌和病毒的DNA或合成的dsDNA进入细胞后可以诱导Ⅰ型干扰素的产生[20]。另外，宿主未降解的基因组DNA 也能在吞噬细胞里聚集，诱导异常免疫反应激活[21]。

Mtb感染巨噬细胞后，通过ESX-1分泌系统介导的吞噬体膜的通透性增强，导致吞噬体内含物和细胞质混合，使细胞内Mtb的DNA可以接近胞质内dsDNA受体。为验证Mtb诱导的IFN-β表达与分枝杆菌DNA的释放相关，敲除胞质内DNA酶TREX1的小鼠感染Mtb后IFN-β表达量明显升高，分离敲除鼠巨噬细胞感染分枝杆菌检测IFN-β表达量也明显上升，这充分说明Mtb感染后引起的Ⅰ型干扰素的表达与胞质内DNA有关。除上述所说的cGAS受体外，该研究还验证了IFI16和IFI204(人源IFI16和鼠源IFI204属同族体)受体在Mtb诱导Ⅰ型干扰素表达中的作用。DNA识别受体进一步激动STING，激动状态下的STING 蛋白招募TBK1、IRF3滑向靠近细胞核的位置，磷酸化IRF3 (p-IRF3)并在此过程中发生聚合形成二聚体，向核内转移。进入到细胞核的p-IRF3刺激相关的DNA片段，转录合成IFN相关RNA，分泌到胞质最终产生IFN。IRF3敲除鼠可以长期抵抗Mtb感染，肺脏、脾脏内的细菌数量降低，说明Mtb的DNA激活的胞质STING-TBK1-IRF3 信号通路有利于Mtb的感染[5]。

STING信号通路在Mtb诱导自噬中的作用

自噬是真核细胞内存在的一种清除细胞内衰老的细胞器、长寿蛋白、某些病原菌及免疫相关因子的高度保守的以形成双层膜结构并最终与溶酶体融合将内含物降解的过程。最近研究表明，诱导自噬有利于清除与控制Mtb感染，自噬相关基因敲除小鼠抵抗Mtb感染的能力降低[5,22]。自噬作为一种宿主抵抗Mtb感染的固有免疫机制被广泛研究。

在自然感染状态下，Mtb的dsDNA 除了激活IFN转录反应外，也可以诱导自噬。同诱导Ⅰ型干扰素表达相同，ESX-1分泌系统介导吞噬体膜破坏，使吞噬体包裹的Mtb进入胞质，激活胞质DNA识别受体如cGAS-STING信号途径，Mtb被宿主泛素连接或者包围，STING通过特异性识别这些被泛素标记的细菌，泛素化的自噬衔接子p62(SQSTM1)和核点蛋白52(nuclear dot protein 52, NDP52)招募自噬成分来形成双层膜环绕在细菌周围，这个过程还需要TBK1激酶和自噬蛋白5(autophagy protein 5，ATG5)的参与。一旦靶向到泛素介导的自噬途径，含有细菌的自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体。该研究证实了激活STING在泛素介导的DNA的自噬的最初环节起到关键性作用[4,7-8]。

未受刺激下，STING 位于内质网，而用dsDNA刺激后，STING快速地从内质网转移到高尔基体，最终与TBK1在细胞质组装，该结构中可观察到P62。TBK1的聚集激活也是dsDNA特异性的，说明STING和TBK1在胞质中组装聚集是由dsDNA刺激特异性引起[23]。用同属胞内寄生菌的沙门菌和单胞李斯特菌感染上皮细胞，发现从内体逃逸进入胞质的细菌被泛素标记，接下来被胞质自噬受体P62和NDP52识别而递呈入自噬体内[24-25]。对Mtb的研究表明，感染后4 h就可以观察到30%的Mtb与泛素共定位，而ESX-1缺失细菌与泛素不会共定位。缺失STING的骨髓源性巨噬细胞(bone marrow derived macrophages，BMDMs)的泛素与Mtb的共定位下降，而且Mtb与NDP52及磷酸化TBK1共定位消失。因此，STING信号通路在介导Mtb进入到泛素标记的特异性的自噬途径过程中发挥着重要的作用。相反的是，有研究表明Mtb感染人源树突状细胞时其ESX-1介导的微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)-Ⅱ的聚集在感染后期会抑制自噬流[26]。这也表明Mtb在自然感染时，宿主与Mtb的相互作用关系复杂，可能还存在细胞的差异。

结 语

我们对Mtb的认识已有100多年，在这么多年的研究过程中，对Mtb的致病机制的认识越来越深入。鉴于最新的关于cGAS信号通路在抗Mtb免疫过程中作用的研究，更多的关于Mtb感染宿主后cGAS的促感染和抗感染作用值得我们进一步研究。尽管cGAS敲除鼠感染Mtb后IFN-β的表达明显减少，但小鼠对Mtb的耐受能力却降低了，各组织器官的含菌量并没有明显的影响[7-8]。不同的是，当IRF3敲除后不仅影响Mtb诱导的IFN-β的表达，也增强了小鼠对Mtb的耐受能力[5]。这是否与Mtb感染能够通过cGAS-STING信号通路诱导选择性自噬有关，以及cGAS信号通路在Mtb抗原递呈及获得性免疫过程中的作用都值得去进一步研究。

研究Mtb在感染宿主之后病原和宿主的相互作用关系，对我们充分认识该疾病具有重要的意义。Mtb感染过程中固有免疫发挥着重要的作用，cGAS介导的固有免疫识别机制不仅是宿主的抗菌机制，同时也是Mtb通过宿主Ⅰ型干扰素的释放促进自身存活的机制。理解宿主和病原两者之间的相互作用关系有利于抗Mtb相关研究的发展。

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(本文编辑：薛爱华)

Research advance in cGAS-STING pathway：a pathway with anti-tuberculosis function of immune system

LIU Chun-fa*, YUE Rui-chao, ZHAO De-ming, ZHOU Xiang-mei.

*National Animal Transmissible Spongiform Encephalopathy Laboratory, College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China

ZHOU Xiang-mei, Email: zhouxm@cau.edu.cn

Mycobacteriumtuberculosis(Mtb) is an intracellular bacterium, it is of great significance for Mtb control to know how to identify the intracellular product and trigger the innate immune response. Stimulator of interferon genes (STING) is an important signal adapter molecule in innate immune system. STING-TANK-binding kinase 1-interferon regulatory factor 3 (STING-TBK1-IRF3) signaling pathways play an important role in the process of expression of type I interferon and autophagy induction in phagocytes infected by Mtb. Recent studies have shown that cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) participates in the innate immune response induced by Mtb. Through secreting bacterial DNA release mediated by ESAT-6 system 1 (ESX-1) secretion system, Mtb activates cGAS-STING pathway. This article will summarize the mechanism and the related studies of this signaling pathway in the process of Mtb infection. It will help to enhance our understanding of pathological process of tuberculosis and the host immune mechanism, and provide some new idea for developing new anti-tuberculosis drugs as well.

Mycobacteriumtuberculosis/immunology； Interferons； Nucleotidyltransferases； Signal transduction； Immunity, innate

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.11.016

国家国际科技合作专项(2013DFG32500)

100193 北京，中国农业大学国家海绵状脑病实验室

周向梅，Email：zhouxm@cau.edu.cn

2015-07-06)