甜瓜CmERFIV-5基因cDNA的克隆·表达分析及载体构建

金乌云， 邵 琪， 郝 鑫， 鲍牧兰， 哈斯阿古拉

(内蒙古大学生命科学学院，内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010021)

甜瓜CmERFIV-5基因cDNA的克隆·表达分析及载体构建

金乌云， 邵 琪， 郝 鑫， 鲍牧兰， 哈斯阿古拉*

(内蒙古大学生命科学学院，内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010021)

[目的]研究甜瓜CmERFIV-5基因的克隆、表达分析及超表达和RNAi载体构建。 [方法]根据GenBank上登录的甜瓜一个乙烯应答因子(ethylene responsive facter，ERF)基因cDNA序列 (登录号：MELO3C024315) 设计合成特异性引物。应用RT-PCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜(CucumismeloL. cv. Hetao) 成熟果实中克隆得到该基因cDNA序列，命名为CmERFIV-5，分析了该基因在甜瓜根、茎、叶及果实发育过程中的表达特性，将其构建到过量表达载体pPZP221中，得到重组植物表达载体pPZP221-CmERFIV-5。同时，构建了该基因RNAi载体pART-27-CmERFIV-5。[结果]序列分析显示，所克隆的cDNA长度为808bp，编码255个氨基酸。荧光实时定量PCR分析表明，CmERFIV-5基因在甜瓜根、茎、叶及不同发育时期的果实中均有表达，在叶片中表达量最高。[结论] 构建了CmERFIV-5基因的过量表达载体与RNAi载体，为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

甜瓜；乙烯应答因子；乙烯；表达；CmERFIV-5

乙烯是一种含2个碳原子的气体分子，又是一种具有生物活性的气体植物激素。1934年，Gane[1]研究证明了乙烯是植物生长发育的内源调节剂。作为植物五大类激素中的一员，乙烯参与并调控植物生长发育过程中的许多生理过程，如种子萌发、叶片衰老、根系生长、果实成熟、器官衰老、应答生物及非生物胁迫等[2-3]，其中乙烯在果实成熟衰老进程中的作用是研究重点之一。乙烯最有代表性的生物学反应是“三重反应”，由于“三重反应” 发生在植物发育的早期且是乙烯的特异反应，有利于大规模筛选乙烯突变体[4]。由此科学家们利用各种突变体材料克隆得到众多乙烯信号转导元件基因，建立了从信号感知到转录调控的乙烯信号转导的大致线性模型，即乙烯→乙烯受体→CTR1→EIN2 →EIN3/EILs→ERF→乙烯反应[5]。

AP2/ERF是一类有众多成员的转录因子超家族，根据其序列的相似性和AP2/ERF 结构域的数量，其分为 AP2、ERF和RAV 3个家族[6]。ERF家族又因所结合的顺式作用元件的不同将其分为两大类，第一类能与GCC盒结合，称为ERF 亚家族[7]；第二类能与DRE/CRT结合，称为CBF/DREB 亚家族[8]。此外，还有一些比较特殊的 ERF 转录因子，如烟草的Tsil既能与GCC盒特异性结合，又能与DRE/CRT特异性结合[9]。

甜瓜(CucumismelonL.)是一种色、香、味俱全的水果，是世界十大水果之一。2012年完成了甜瓜全基因组测序[10]，为甜瓜功能基因组研究奠定了基础。Ma等[11]在甜瓜全基因组中对AP2/ERF转录因子超家族成员进行了鉴定，发现有136个成员，其中ERF家族最多，包含119个成员，聚类分析可将其分成11个群。笔者对第4个群的第5个成员的基因CmERFIV-5 cDNA进行了克隆和表达特性分析，构建了CmERFIV-5 基因过量表达载体与RNAi载体。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂所用植物材料为内蒙古地方甜瓜品种河套蜜瓜，原种由内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室保存。采摘九成熟果实，取中果皮组织于液氮速冻，-80 ℃保存，用于基因克隆。采摘授粉后0、10、20、30、40 d的果实，取中果皮组织，于液氮速冻。选取甜瓜子房及30日龄根、茎、叶等不同组织,于液氮速冻，用于分析CmERFIV-5 基因的表达特性，为保证数据的可靠性，每天9：00采集样品，采样生物学重复3次。

RNA提取试剂盒RNAiso Plus (Total RNA extraction reagent)克隆载体pEasy®-Blunt、T4DNA 连接酶、限制性内切酶、氨苄青霉素、DNAmarker、Prime-STARTMHS DNA 聚合酶、dNTPs以及SYBR®PremixExTaqTM实时定量 PCR 试剂盒等购自大连宝生物公司；TransStart®Pfu DNA Polymerase购自北京全氏金生物技术有限公司；AMV第一链cDNA合成试剂盒；柱式PCR 产物纯化试剂盒、柱式DNA胶回收试剂盒、柱式质粒DNA小量抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1引物设计与合成。根据GenBank上登录的甜瓜一个乙烯应答因子(ethylene responsive facter，ERF)基因cDNA序列(登录号：MELO3C024315)和甜瓜甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)基因cDNA序列(序列号：AB033600)，使用Primer Premier 5.0分别设计引物。目的基因克隆引物P1：5′-GCTCTAGACACTCAGCTgTTTGTGTTTTCC-3′ (下划线部分为XbaⅠ内切酶位点)和P2：5′-TAGGTACCCAACATCAGAAGAAGCTGGACT-3′(下划线部分为KpnⅠ内切酶位点)。目的基因定量PCR检测引物P3：5′-GGCTTCATTCCGCCGACTC-3′和P4：5′-GCTCCTCCACATCAAATTCCAAA-3′。内参基因定量PCR检测引物P5：5′-ATCATTCCTAGCAGCACTGG-3′和P6：5′-TTGGCATCAAATATGCTTGACCTG-3′及RNAi载体构建引物P7：5′-TAGGATCCGAGGTGCTATAATCTCCGGCTT-3′(下划线部分为BamHⅠ内切酶位点)、P8：5′-GAATCGATGAGCTGAAGGAACAGGAGGGT-3′(下划线部分为ClaⅠ内切酶位点)、P9：5′-CAGGTACCGAGGTGCTATAATCTCCGGCTT-3′(下划线部分为KpnⅠ内切酶位点)、P10：5′-TACTCGAGGAGCTGAAGGAACAGGAGGGT-3′(下划线部分为XhoⅠ内切酶位点)，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2总RNA 提取及cDNA第一链的合成。采用TaKaRaTM公司RNAiso Plus试剂提取甜瓜总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，-80 ℃保存备用。取5 μl总RNA为模板，按照AMV第一链cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA。1.2.3cDNA PCR扩增、克隆及序列分析。以cDNA第一链为模板，P1、P2为引物，用Prime-STARTMHS DNA 聚合酶PCR扩增，采用 25 μl反应体系，反应参数为：95 ℃预变性10 min;95 ℃变性20 s，51 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，25个循环；72 ℃延伸补平5 min。RT-PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物纯化后与pEasy®-Blunt克隆载体连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，阳性克隆送至上海生工生物工程有限公司测序。克隆得到的该基因cDNA序列，命名为CmERFIV-5。

将得到的测序结果与甜瓜基因库(https://melonomics.net/)中的甜瓜ERF基因MELO3C024315序列比对，通过ORF Finder(http://www.ncbi.n lm.nih.gov/gorf.html)对CmERFIV-5序列进行开放阅读框分析。

1.2.4基因表达特性分析。按照RNAisoPlus试剂盒说明书提取甜瓜授粉后0、10、20、30、40 d果肉总RNA。采集1/2MS 培养基中培养37 d甜瓜植株第五六片真叶、第五六片真叶间的茎段以及根样品，提取总RNA。反转录合成cDNA，分别用P3和P4、P5和P6为引物，SYBR®PrimixExTaqTM实时定量PCR试剂盒进行定量PCR分析，PCR程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s；60 ℃延长30 s，共进行40个循环，数据采用2-△△CT方法进行分析[12]。将授粉后第0天的甜瓜果实基因表达量设定为1，标准偏差(SE)来自3个生物重复和3个技术重复。

1.2.5过量表达载体的构建。利用XbaⅠ和KpnⅠ酶切位点将克隆好的CmERFIV-5基因cDNA插入植物双元表达载体pPZP221的相应多克隆位点，构建过量表达载体pPZP221-CmERFIV-5。

1.2.6RNAi载体的构建。分别用P7和P8、P9和P10两对引物扩增CmERFIV-5基因cDNA ORF 179～445 bp的片段，双酶切后，分别重组到中间载体pKANNIBAL的PDK内含子的两侧，构建成RNAi中间载体pKAN-CmERFIV-5；再利用NotⅠ酶切位点将pKAN-CmERFIV-5载体上的“正向序列-PDK序列-反向序列”插入到植物表达载体pART-27的NotⅠ酶切位点，构建成RNAi载体pART-27-CmERFIV-5。

2 结果与分析

2.1 cDNA克隆及序列分析经RT-PCR扩增得到约800 bp的特异性条带，与预期相符。测序结果与甜瓜基因库(https://melonomics.net/)中MELO3C024315序列相似度高达100%。用NCBI的ORF Finder软件在线分析克隆序列，表明所克隆CmERFIV-5基因的cDNA全长808 bp，5′非编码区长35 bp，3′编码翻译区长5 bp，预测的ORF为768bp，编码255个氨基酸(图1)。

2.2 基因的表达特性分析实时荧光定量PCR检测结果表明(图2)，CmERFIV-5基因在甜瓜根、茎、叶及不同发育时期的果实中均有表达，在叶片中的表达量最高；在不同发育时期的果实中，授粉后第40天的表达量最高，其次是第20天。

2.3 过量表达载体构建挑取转化菌落，提取重组质粒pPZP221-CmERFIV-5，选用限制性内切酶XbaⅠ和KpnⅠ进行双酶切鉴定，电泳结果显示产生约0.8 kb预期片段。以质粒pPZP221-CmERFIV-5 为模板进行体外扩增，扩增出特异性片段约0.8 kb，表明已将CmERFIV-5 基因cDNA成功插入到植物表达载体pPZP221中。

2.4 RNAi载体构建用限制性内切酶NotⅠ切割重组质粒pART27-CmERFIV-5，产生约3.3 kb预期片段。以质粒pART27-CmERFIV-5为模板，PCR扩增出特异性片段约0.8 kb，表明CmERFIV-5 基因的RNAi载体构建成功。

3 讨论

ERF类转录因子属于AP2/ERF家族，主要调控乙烯应答以及相关逆境响应基因的表达,且在植物抵抗生物与非生物胁迫过程中发挥重要作用[13-15]。目前有关ERF在果实成熟衰老过程中的研究较少。番茄LeERF2(AAO34704,第Ⅶ族ERF)的表达水平在果实成熟衰老过程中呈增强趋势[16]，表明参与了果实的成熟衰老进程。在苹果中ERF家族成员MdERF1主要在成熟果实中表达，在其他组织中很少表达，研究认为同属于Ⅶ族ERF的苹果MdERF1与番茄LeERF2在果实成熟衰老过程中起相似的作用[17]。葡萄果实中的ERF1基因表达量自始熟期持续增加，直至完熟期转录水平达到最高，表明乙烯信号途径可以在果实始熟期之后对果实成熟衰老发挥重要调控作用[18]。转基因研究进一步显示，抑制属于第V族ERF的LeERF1(AAL75809)可有效延缓番茄果实的成熟过程[19]，表明ERF在果实成熟衰老过程中具有重要的调控作用。在甜瓜中，ERF亚家族基因共有64个，分为6个亚族[11]，为研究其第IV组第5个成员CmERFIV-5在甜瓜植株生长发育及果实成熟中的功能，该研究进行了甜瓜CmERFIV-5基因的克隆、表达分析及超表达和RNAi载体构建。该基因在叶片中的表达量最高；在果实发育的不同阶段，CmERFIV-5基因表达水平不同，总体呈上升趋势，推测CmERFIV-5基因在甜瓜叶和果实成熟中发挥作用。

4 结论

该研究以甜瓜品种河套蜜瓜为材料，克隆了CmERFIV-5基因 cDNA，长度为808 bp，编码255个氨基酸；CmERFIV-5基因在甜瓜根、茎、叶及不同发育时期的果实中均有表达，在叶片中表达量最高；构建了CmERFIV-5基因的过量表达与RNAi载体，为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

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Cloning，Expression Analysis and Vector Construction of theCmERFIV-5 Gene cDNA from Melon (CucumismeloL.)

JIN Wu-yun， SHAO Qi， HAO Xin， HASI Agula*et al

( College of Life Sciences,Inner Mongolia University;Inner Mongolia Key Laboratory of Herbage &Endemic Crop Biotechnology,Hohhot,Inner 010021)

[Objective] The aim was to study cloning，expression analysis and vector construction of theCmERFIV-5 gene cDNA from melon (CucumismeloL.)[Method]A pair of specific primer was designed according to the cDNA nucleotide sequence in GenBank (accession number: MELO3C024315) of an ethylene responsive facter gene cDNA from melon(CucumismeloL. cv. Hetao). The cDNA of the gene was cloned by RT-PCR from mature fruit of melon, which the gene was namedCmERFIV-5. The gene expression patterns were characterized inCucumismeloL.melon root，stem，leaf and fruit of different developmental stage . The cDNA of theCmERFIV-5 was cloned into the overexpression vector pPZP221 to construct the recombinant plant expression vector pPZP221-CmERFIV-5. Meanwhile, the RNAi vector pART-27-CmERFIV-5 was constructed. [Result]Sequence analysis indicated that the cDNA was 808 bp which incodes a polypeptide of 255 amino acids. Quantitative real-time PCR analysis showed that theCmERFIV-5 expressed ubiquitously in roots, stems, leaves and different developmental stages of fruit and the highest transcription was in leaves.[Conclusion] Overexpression vector and RNAi vector ofCmERFIV-5 gene was constructed, and laid the foundations for the further research of the gene function .

Melon; Ethylene responsive facter; Ethylene; Express;CmERFIV-5

国家自然科学基金项目(31360486)。

金乌云(1991- )，女，内蒙古兴安盟扎赉特旗人，硕士研究生，研究方向：植物分子生物学及基因工程。*通讯作者，博士，教授，从事植物分子生物学及基因工程研究。

2015-04-02

S 652

A

0517-6611(2015)14-030-03