大川芎鼻腔给药用离子敏感即型凝胶的制备及其毒性初步评价＊

陈伯丛，梁晓燕，罗德祥

(广东省佛山市中医院药剂科，广东 佛山 528000)

原位凝胶是指高分子聚合物的溶液因温度、离子强度或pH的改变而在用药部位发生相转变，形成的半固体制剂。这种对外界物理或化学条件的微小变化发生响应的性质，在药物控制释放领域得到了广泛应用。由于兼具液体与凝胶制剂的优点，该药物传递系统已逐步发展成为环境敏感凝胶最受瞩目的分支。大川芎方主含川芎、天麻，处方来源于《宣明论方》，临床用于偏头痛尤其是寒凝血瘀、脑窍不利等症状，经数十年临床验证，疗效确切。综合考虑各药味的有效成分性质及鼻腔给药的优势，将其开发研究成以去乙酰结冷胶(deacetylated gellan gum，DGG)为基质的鼻腔给药用的离子敏感即型凝胶。现将其制备方法及毒性初步评价报道如下。

1 仪器与试药

Waters 2695 -2996 型高效液相色谱仪;Mettler AE 200 型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。去乙酰结冷胶(上海众伟化工有限公司，批号20130801);其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验[1]

色谱柱:Kromasil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈(A) -1%磷酸溶液(B)，按表1 进行梯度洗脱;流量:1.0 mL/min;进样量:20 μL。检测器漂移管温度为70 ℃，载气压力为30 psi(1 psi=6.894 7 kPa)，柱温为25 ℃，DAD 检测器的检测波长270 nm(天麻素)、321 nm(阿魏酸)。在该色谱条件下，天麻素和阿魏酸理论板数均为6 000，分离度分别为4.1 和8.4，可达基线分离，其他成分对测定无干扰。

表1 流动相梯度洗脱表

2.2 制剂处方设计与优选研究

2.2.1 基本处方确定

根据预试验结果，先确定基本处方，在此基础上以制剂黏度的变化及体外释药性能为指标进行处方筛选。为满足药物鼻腔喷雾溶液的等渗性及防腐性，需加入5%甘露醇和0.01%的醋酸洗必泰，基本处方见表2。

2.2.2 渗透压调节剂、防腐剂确定

为了使制剂的渗透压调节在生理范围内，加入5%甘露醇作为渗透压调节剂，同时加入0.02%的醋酸洗必泰作为防腐剂。成凝基质筛选的重点主要集中在去乙酰结冷胶的用量上。

表2 基本处方

2.2.3 去乙酰结冷胶用量筛选

制剂黏度测定:称取一定量的去乙酰结冷胶至适当容器中，加入适量的去离子水，在磁力搅拌下加热至100℃使其分散均匀，按 表2 成 分 制 成 含0.1% ，0.2% ，0.3% ，0.4% ，0.5% ，0.8%，1.0%的去乙酰结冷胶溶液。参照2010 年《中国药典(二部)》附录黏度测定第二法，使用旋转黏度计，于体温条件下测定不同去乙酰结冷胶浓度溶液的动力黏度，绘制浓度-黏度曲线，以此考察适宜的制剂黏度。同时将0.2%，0.4%，0.8% 3 种浓度的去乙酰结冷胶制剂与等量体积的人工鼻液反应，以相同方法测定制剂反应后的黏度，并观察凝胶形态。

制剂释药性能考察:参考文献[2]采用改良的Franz 扩散池测定大川芎即型凝胶的体外释放度，将半透膜(截留相对分子质量6 000 ～8 000)用502 胶固定在扩散池两池间，扩散池两池内径为1.3 cm，释药面积约为1.33 cm2，向给药池中准确加入2 mL大川芎即型凝胶，将扩散池放入16 mL 的37 ℃人工鼻液中，向接收池中加入已预热至37 ℃的人工鼻液10 mL 作为接收液，接收池中置一搅拌子以100 r/min 的转速转动，于15，30，45，60，90，120，180 min 分别取样，将介质全部取出并迅速补加等量预热的人工鼻液，样品液经适当稀释，0.45 μm 微孔滤膜过滤，并续滤液按2.1 项下色谱条件，测定阿魏酸、天麻素的峰面积，计算累积释放度。

筛选结果:去乙酰结冷胶溶液浓度为0.1% ～0.5%时，黏度较低，黏度随去乙酰结冷胶的浓度的增加而缓慢上升，当去乙酰结冷胶的浓度增加至0.8%甚至1%时，整个体系的黏度有突跃现象，达到5 000 mPa·s。对于3 种去乙酰结冷胶浓度的制剂，体系粘度均随剪切速率增大呈明显下降趋势，其中0.4%的去乙酰结冷胶溶液在反应前具有一定的黏度，与人工鼻液反应后黏度有明显提高。同时经目测观察发现，0.4%去乙酰结冷胶溶液也可形成粘稠状的凝胶，0.2%和0.8%的去乙酰结冷胶溶液虽然也具有遇人工鼻液胶凝的特性，但前者欠缺反应前后黏度的突跃特性，后者反应前后黏度变化不大，始终停滞于较高水平。0.4%的去乙酰结冷胶制剂形成均一、柔软的凝胶，累积释放量也呈缓慢上升之势，其在起初的时间里药物释放较快，但无明显突释现象，分析原因可能是聚合物胶凝的滞后时间导致制剂在进入体内到形成凝胶这段时间内存在药物的快速释放。在发生凝胶反应的过程中，聚合物仍以液体形式存在，药物很快从溶液中扩散出去从而导致药物释放。因此，最理想的去乙酰结冷胶的用量应控制在0. 4%。

2.2.4 最终处方

称取处方量醋酸洗必泰至适当容器中，加入适量的去离子水搅拌使之溶解，然后加入处方量去乙酰结冷胶，在磁力搅拌下加热至100 ℃使其分散均匀，然后置4 ℃冰箱中完全冷却，得到澄明溶液，最后加入甘露醇及大川芎提取物搅拌使其溶解，用去离子水定容至总量，分装于喷雾瓶中，装上鼻腔喷雾剂泵，即得。大川芎即型凝胶的最终处方见表3。

表3 最终处方(g)

2.3 毒性评价

2.3.1 局部刺激性试验

取SD 大鼠30 只，随机分成3 组，每组10 只。设置大川芎即型凝胶给药组、空白对照组(给予生理盐水)、赋形剂组(空白即型凝胶基质)。每天给药1 次，连续7 d，在最后一次给药后24 h 处死大鼠，取出局部鼻腔黏膜，观察有无充血、红肿等现象，如有变化则进行病理组织学检查。结果显示，连续7 d 给药后，大川芎即型凝胶组、赋形剂组和空白对照组动物的全身状况未见明显改变，也未见哮喘、咳嗽、呕吐、窒息等局部刺激症状。处死后观察局部黏膜组织，各组均无充血、红肿、溃破等现象。提示常规用药剂量下，该鼻腔喷雾剂不会对用药者的局部组织产生明显的刺激作用。

2.3.2 蟾蜍上颚黏膜纤毛运动影响试验

选取中华大蟾蜍20 只，随机分成4 组，每组5 只，即大川芎即型凝胶给药组;赋形剂组，即空白即型凝胶基质;空白对照组，即0.9%氯化钠注射液;阳性对照组，即去氧胆酸钠溶液。将蟾蜍仰卧固定，使口腔张开，于上颚黏膜处滴加试验样品溶液0.5 mL，使浸没上颚黏膜，持续接触4 h 后用生理盐水洗净，分离并洗净上颚黏膜，将黏膜面向上平铺于载玻片上，滴加生理盐水，盖上盖玻片，于44 ×10 倍光学显微镜下观察纤毛的运动情况。观察完毕，将载玻片搁置加有少量蒸馏水的层析缸中，密闭，20 ～25 ℃条件使缸内水蒸气近饱和。每隔一段时间取出标本观察，记录从洗净试验样品至纤毛运动停止的时间。以生理盐水为阴性对照组，用试验样品的纤毛持续运动时间除以对照组的时间得纤毛持续运动相对百分率，百分率越高，表示试验样品对纤毛的毒性影响越小。

结果显示，给予生理盐水的阴性对照组，光学显微镜观察发现，蟾蜍上颚黏膜面完整，无纤毛脱落现象，纤毛运动非常活跃，纤毛持续运动时间平均为(970 ±45)min。给予鼻腔喷雾剂基质后，光学显微镜观察显示，黏膜面完整，纤毛数量多，运动活跃，与生理盐水对照组相比无显著差异。给予大川芎即型凝胶后，光学显微镜观察发现黏膜表面部分纤毛运动略有减弱，纤毛持续运动时间百分率也略低于阴性对照组，表明大川芎即型凝胶对纤毛运动有一定的影响，但并不严重，可以用于临床。给予去氧胆酸钠后，黏膜表面杂乱，纤毛完全脱落，说明其对黏膜组织及纤毛运动有严重影响。

3 讨论

大川芎鼻用即型凝胶剂以去乙酰结冷胶为凝胶基质，以溶液喷雾的形式给药，与鼻腔黏膜接触后因环境离子强度的变化而发生相转变，形成凝胶。在制备的过程中，由于醋酸洗必泰较难溶于水，因此先加入大量的水搅拌并溶解，然后按顺序加其他成分制备大川芎即型凝胶。

多糖衍生物去乙酰结冷胶的水溶液具有阳离子诱导凝胶的性质，即在常规条件下是自由流动的液体而在某些生理条件下可形成澄明的凝胶。有研究表明，去乙酰结冷胶为阴离子型线性多糖，具有平行的双螺旋结构，溶液中的一价或二价阳离子与聚合物链上的羰基络合，参与形成稳定双螺旋的链间氢键，每2 条双螺旋逆向聚集，构成三维凝胶网络[2]，利用这一独特性质可设计鼻用、眼用制剂以及植入给药系统。因此，本研究中基于此性质制备了大川芎提取物鼻腔给药用即型凝胶。

[1] 徐艳丽，刘天富，王中彦，等. HPLC 测定注射用大川芎(冻干)中阿魏酸和天麻素的含量[J]. 中成药，2006，28(9)：1 281 -1 284.

[2] 曹师磊. 离子敏感即型凝胶剂在鼻腔给药系统中的应用[D]. 上海：复旦大学，2007.