奥沙利铂对原发性肝癌细胞系HUH-7的抗肿瘤效果评价

朴莲淑 王迎春

大连大学附属中山医院消化内科，辽宁大连 116001

奥沙利铂对原发性肝癌细胞系HUH-7的抗肿瘤效果评价

朴莲淑 王迎春

大连大学附属中山医院消化内科，辽宁大连 116001

目的探讨奥沙利铂对原发性肝癌细胞系HUH-7是否会产生作用和影响，根据其对抗肿瘤的效果决定是否能够应用于对肝癌细胞的临床治疗。方法把中科院2012年3月—2014年4月的肝癌细胞作为该试验的研究对象，用流式细胞仪器对癌细胞的分布周期和死亡状况进行分析，运用MTT法测试不同浓度和不同的作用时间的奥沙利铂对肝癌细胞增长繁殖的抑制效果。通过多次试验，得出最终结论。结果经过48 h作用后，癌细胞死亡率达到了11.8%，可见奥沙利铂对于肝癌细胞的繁衍增长有着很强的抑制功效，并且呈现出计量和时间的依赖性。结论奥沙利铂对原生性肝癌细胞系HUH-7的抗瘤效果明显，它可以抑制肝癌细胞繁殖，使细胞周期停留在S期和G2PM期之间，进而使癌细胞死亡。但是其具体的运行机制还有待研究，因而奥沙利铂能否应用于临床治疗还不能盖棺定论。

奥沙利铂；原发性；肝癌细胞；效果

原发性肝癌对人身体危害极大，且不易治愈。传统的治疗方法以手术为主，化疗为辅。但是，这一治疗方式有很大不足之处。有很多肝癌患者发现自己的病情、进行治疗时肝癌已经发展到晚期，不能进行手术，因为此时的病人的体制已经太差，经不起手术的折腾。而且，近几年肝癌患者在经过手术治疗后，肝癌细胞发生转移的几率也越来越大。癌细胞的抗药性很强，不利于患者的术后化疗康复。因此，必须要找到一种能防止肿瘤转移增殖的中药来辅助治疗。这样一来，肝癌的中西医联合治疗法就成为一种十分有益的辅佐方法。

大量的临床资料显示，奥沙利铂对于多种类型肿瘤的治疗都有很好的效果。它可以有效抑制癌细胞再生，且很安全无不良反。但是却很少有人研究奥沙利铂在人体内对肝癌细胞的影响。在该研究里，把中科院2012年3月—2014年4月的肝癌细胞作为该试验的研究对象，就对这一问题进行研究，为它的临床应用提供可靠的理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 细胞株QGY 由中科院细胞生物研究所提供的细胞株。这些细胞株是在含有15%胎牛血清RPMI1640营养液中,置于37℃、5%CO2环境下而培养出的。

1.1.2 试剂 分子量是396.97的奥沙利铂，在使用时，可以用浓度为5%的葡萄糖注射液稀释其浓度至所需浓度。胎牛血清。MTT，即甲基偶氮唑盐。发生突变的Bax、Fas、P53等。

1.1.3 主要仪器 型号为HITACH-I600透视型电子显微镜 （日本）、型号为BIO-RAD2550的全自动酶标读数仪器（美国）、倒置显微镜（日本）、流式细胞仪（美国）。

1.2 方法

1.2.1 检测奥沙利铂对细胞株的影响的方法 使用甲基偶氮唑盐比色的方法进行实验。用1.1%的胰蛋白酶将所选取的QGY细胞株进行消化，再放入胎牛血清浓度为15%的培养液中，将细胞株制成50 000/mL浓度的细胞液。并以200l1每孔的分量在96个培养板中进行接种。培养条件为37℃、5%CO2，培养时间分别是1 d、2 d。达到培养时间后，再取出原液，加入一定比例的培养液继续进行培养。

1.2.2 检测奥沙利铂对癌细胞周期的作用的方法 用流式细胞仪器进行分析。把浓度为71%的乙醇加入到取得的细胞中用PI进行染色30 min。并用流式细胞仪器分析细胞周期的变化和肝癌细胞的死亡状况。

1.2.3 检测奥沙利铂对基因蛋白的影响的方法 用免疫组织化学方法，对细胞株进行特殊培养，观察其染色情况，按公式计算出相应的HSCORE得分。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 奥沙利铂对细胞的作用

奥沙利铂能够有效抑制肝癌细胞的增长，而且对剂量有很强的依赖作用，药物的浓度越高，抑制作用越强；对时间也有依赖作用，抑制作用随着药物作用时间的增长而增长。即奥沙利铂的浓度不同或者时间作用不同对肝癌细胞产生的影响程度也不同。见表1。

表1 比色（MTT）法检验出的奥沙利铂对癌细胞的影响（）

表1 比色（MTT）法检验出的奥沙利铂对癌细胞的影响（）

奥沙利铂浓度24 h 48 h FP 16LmolPL 32LmolPL 64LmolPL 128 LmolPL 0.189 8±0.056 0.213 5±0.038 2 0.275 2±0.075 0.0173±0.817 7 0.390 2±0.013 5 0.607 1±0.061 9 0.743 2±0.016 4 0.817 6±0.041 4 348.178＜0.02

2.2 奥沙利铂对细胞株周期和死亡情况的影响

奥沙利铂对肝癌细胞作用时间达到24 h后，癌细胞周期基本都停在了S周期；在作用时间达到48 h后，细胞周期就被迫停在了S期和G2PM期之间，但仍主要在停在S期。而且奥沙利铂作用于肝癌细胞24 h、48 h后，肝癌细胞死亡率分别是6.27%、11.8%，由此可见，随着奥沙利铂作用时间的增长，肝癌细胞的死亡率也在增长。

2.3 奥沙利铂对相关基因蛋白的影响

使用奥沙利铂后，Cyclin A定位在胞核中;MTP53阳性表达见于胞核 ;Bc-l 2、Bax及Fas定位在胞浆中;Myc的阳性表达于胞浆和胞核可见。奥沙利铂作用于癌细胞72 h后,免疫细胞化学表Cyclin A、Bax表达增强(P＜0.03),MTP53、Bc-l 2及Myc表达减弱(P＜0.02),Fas表达差异无统计学意义(P＞0.06)。见表2。

表2 奥沙利铂对QGY细胞周期蛋白及凋亡相关基因蛋白表达的影响（）

表2 奥沙利铂对QGY细胞周期蛋白及凋亡相关基因蛋白表达的影响（）

医抗体标本抑制奥沙利铂表达方法 P细胞周期蛋白Cyclin A MTP53 Bc-l Bax Myc Fas 20 2.820±0.020 2.935±0.019 0.019＜0.01 20 20 20 20 20 2.771±0.009 2.787±0.005 2.367±0.102 2.675±0.007 2.686±0.011 2.502±0.007 2.669±0.005 2.726±0.005 2.520±0.008 2.675±0.029 0.007 0.005 0.005 0.008 0.029＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＞0.05

3 讨论

在该研究中，采取了两种方法对奥沙利铂对癌细胞的作用进行了研究，有两个重大发现：一是药物作用于癌细胞48 h后，将癌细胞阻断在S期和G2PM期之间，使癌细胞死亡率达到了11.8%；二是奥沙利铂浓度为16 mol/L作用24 h影响为（0.189 8± 0.056），浓度为升为128 mol/L作用48 h影响升为了（0.817 6± 0.041 4）。实验表明：奥沙利铂对癌细胞有影响，能够将肝癌细胞全部停留在S期和G2PM期之间，并逐步产生作用，诱导肝癌细胞走向凋亡。且奥沙利铂对肝癌细胞起的作用大小呈现出对剂量、时间的依赖性。

大量历史资料[2-3]表明：很多抗癌的药品不会直接消灭肝癌细胞而是通过诱导机制使其逐步走向死亡，因为抗癌药物在消灭癌细胞的同时可能会对正常的细胞产生不良作用。因而，研究新型的能诱导癌细胞自动凋亡的抗癌药物是现代抗癌治疗的新渠道。而奥沙利铂是第3代铂化合物，它能够中断DNA的合成，从而使癌细胞失去存活、增殖的基础，有效抑制癌细胞增长，诱导其凋亡。

实验证明，奥沙利铂可以应用于肝癌的临床治疗，而且能够取得很好的效果，是未来抗癌的一种重要的药物。进一步对其进行开发研究，进行更多的实验验证，使其得到广泛的临床应用是医学界的重要课题。

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[2]高洁，吴穷，杨清玲，等.奥沙利铂对肝癌细胞HuH-7细胞周期的影响[J].华中科技大学学报：医学版，2012,41（4）：445-449.

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Oxaliplatin for hepatocellular carcinoma cell line HUH-7 anti-tumor effect of the evaluation

PU lianShu WANG Yingchun
Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian Medical University,Dalian,Liaoning Province,116001 China

ObjectiveTo observe the effect of oxaliplatin on hepatocellular carcinoma cell line HUH-7 will produce the effect and influence,according to the anti-tumor effect decided whether to apply in the clinical treatment ofhepatocellular carcinoma cells.MethodsHepatoma cells as the object of study in this experiment,the distribution of cancer cell cycle were analyzed by flow cytometry instrument and death situation,using MTT method to test the inhibitory effect of different concentrations and different action time of oxaliplatin on hepatocellular carcinoma cell growth and reproduction of.Through many experiments,and draw the final conclusion.ResultsAfter 48 hours after the action of cancer cell death rate reached 11.8%,visible Asha Leigh Per has a very strong inhibitory effect on liver cancer cells multiplygrowth,and presents the measurement and time dependence.ConclusionAnti tumoreffect conclusion oxaliplatin on primary hepatocellular carcinoma cell line HUH-7 is obvious,it can inhibit the hepatoma cell reproduction,so that the cell cyclehere between the S phase and G2PM phase,and then make the death of cancer cells.But the specific operation mechanism remains to be studied,which could be used in the clinical treatment of oxaliplatin is not conclusive.

Asha Leigh Per;Primary;Hepatocellular carcinoma cell;Effect

R735

A

1674-0742（2015）02（c）－0089-03

2014-11-18）

朴莲淑(1979.6-)，女，朝鲜族，吉林舒兰人，博士，主治医师，研究方向：肝硬化基因研究与干细胞治疗，原发性肝癌基因研究与肿瘤肝细胞研究。