响应面法优化对叶百部生物碱提取工艺的研究

刘颖坤， 蔡铃潇， 张爱莲* ， 汪云珍， 包志泉， 严红梅

(1. 浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江临安311300;2. 临安市林业局，浙江临安311300;3. 建德市新安江林场，浙江 建德311600;4. 建德市寿昌林场，浙江 建德311612)

对叶百部为百部科植物对叶百部Stemona tuberosa Lour.的干燥块根，分布于福建、台湾、江西、湖北和云南等省市［1］，具有润肺下气、止咳和杀虫的功效，为《中国药典》2010 年版所收载百部药材的3 个来源之一［2］。生物碱是百部的主要活性成分，具有良好的杀虫、抗菌和镇咳祛痰等作用［3］。目前，对叶百部总生物碱的定量测定研究很少，且局限于有机溶剂提取［4］。双水相萃取(aqueous twophase extraction，ATPS)［5］能够克服传统提取分离的耗时长、工作量大和有机溶剂毒性大等缺点，是近年来引人注目的新型分离技术［6］。

响应面分析法(response surface methodology，RSM)是一种优化工艺条件的有效方法［7］，可用于确定各因素及其交互作用在工艺过程中对指标(响应值)的影响，精确地表述因素与响应值之间的关系，在试验设计与结果表达方面比以往推广的正交设计法更加优良［8］。

本实验采用双水相体系提取，利用酸性染料比色法测定对叶百部总生物碱提取率［9］，通过响应面优化法考察有机物用量、无机盐用量和料液比3 个因素对生物碱提取率的影响，确定最佳提取工艺，以期为对叶百部生物碱的生产开发奠定理论基础。

1 仪器与试剂

UV-2550 紫外分光光度计(日本岛津公司)，SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，BUCHI旋转蒸发仪(上海岛通应用科技有限公司)，AB104-N 电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，SWB5200 型超声清洗机(上海必能信超声有限公司)，DGG-9070 电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)。

对叶百部碱对照品(纯度≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司，批号A0326)，溴甲酚绿(上海三爱思试剂有限公司)，0.05%溴甲酚绿缓冲液(自制，取0.2 mol/L 醋酸钠70 mL 和0.2 mol/L 醋酸30 mL，配得pH 5.0 的缓冲液;取溴甲酚绿0.05 g，加入pH 5.0 的缓冲液100 mL，溶解，滤过，即得)，聚乙二醇1000 (PEG1000)(上海浦东高南化工厂)，无水醋酸钠(温州润华化工实验公司)，硫酸钠(湖州湖试化学试剂有限公司)，其他试剂均为分析纯。

百部药材购买于浙江临安钱王大药房(按参考文献［10］的方法对药材进行鉴定，结果表明其为对叶百部)。将药材置于50 ℃烘箱中烘干至恒定质量，粉碎，过60目筛。

2 方法

2.1 标准曲线的制作 精密称取对叶百部碱5.0 mg，甲醇定容至5 mL，制得质量浓度为1.0 mg/mL 的对照品贮备液。取贮备液逐级稀释，得质量浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL 的系列对照品溶液。

分别精密吸取系列对照品溶液0.1 mL，置分液漏斗中，依次加入蒸馏水5 mL、0.05%溴甲酚绿缓冲液2 mL、三氯甲烷10 mL，振摇1 min，静置1 h 后，取三氯甲烷层在417 nm 波长测定吸光度。另取0.1 mL 甲醇，同法操作，作为空白对照。以吸光度为纵坐标(Y)，对照品质量浓度为横坐标(X)，进行回归计算，得到标准曲线及回归方程Y=1.570 45X-0.003 53，r2=0.999 1 (n=5)。实验表明，对叶百部碱在0.1 ～0.8 mg/mL 范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2 对叶百部生物碱的提取与测定 精密称取药材0.5 g于锥形瓶中，按一定料液比加入双水相体系溶液(PEG1000 溶液-Na2SO4溶液体积比3 ∶2)，超声提取一定时间，抽滤，滤液置于分液漏斗静置分层，取上层PEG1000 溶液，50 ℃减压浓缩回收溶剂，用甲醇定容至10 mL，得供试液。按“2.1”项下操作测定吸光度，根据回归方程计算出供试液中生物碱质量浓度，按下式计算得生物碱的提取率，每组试验重复3 次。

2.3 单因素设计

2.3.1 Na2SO4用量比较 精密称取5 份0.5 g 样品，保持其他条件不变 (PEG1000 质量分数30%，超声时间50 min，料液比为1 ∶30)，调整Na2SO4质量浓度分别为0.25、0.3、0.35、0.4 和0.45 g/mL，按“2.2”项下方法检测提取物中的生物碱提取率，重复3 次。

2.3.2 PEG1000 用量比较 精密称取5 份0.5 g 样品，保持其他条件不变(Na2SO4质量浓度为0.35 g/mL，超声时间50 min，料液比1 ∶30)，调整PEG1000 的质量分数分别为10%、20%、30%、40%和50%，按“2.2”项下方法检测提取物中的生物碱提取率，重复3 次。

2.3.3 料液比优化 精密称取5 份0.5 g 样品，保持其他条件不变(Na2SO4质量浓度0.35 g/mL，PEG1000 质量分数30%，超声时间50 min)，调整料液比1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40，1 ∶50，按“2.2”项下方法检测提取物中的生物碱提取率，重复3 次。

2.3.4 超声时间比较 精密称取5 份0.5 g 样品，保持其他条件不变(Na2SO4质量浓度0.35 g/mL，PEG1000 质量分数30%，料液比1 ∶30)，分别超声10、20、30、40、50、60 min，按“2.2”项下方法检测提取物中的生物碱提取率，重复3 次。

2.4 响应面设计试验 根据单因素试验的结果，选择PEG1000 用量、Na2SO4用量和料液比3 个因素，按照“2.2”项下操作测定提取物中对叶百部生物碱提取率，进行3 因素3 水平共15 个试验点(3 个中心点)的响应面分析试验，使用Design-expert software 7.1.3 Trial 软件 (美国)进行数据分析，求出数学模型，进而得到最佳的提取工艺条件。

2.5 回流法提取百部中生物碱 精密称取百部样品粉末0.5 g，加15 mL 体积分数为70%的乙醇，回流时间1 h，提取温度80 ℃。滤过，滤渣用少量提取试剂冲洗滤过，合并所有滤液，50 ℃减压浓缩至干，残渣用甲醇溶解，转移至10 mL 量瓶中，定容，摇匀，作为供试品溶液，按照“2.2”项操作，测定样品中的生物碱提取率。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 Na2SO4用量对生物碱提取率的影响 从图1 可以看出，随着Na2SO4用量的增大，生物碱提取效率逐渐增加，在Na2SO4质量浓度0.35 g/mL 时，生物碱提取率达到最高，之后生物碱提取率出现下降，故选择Na2SO4用量在0.35 ～0.4 g/mL 为宜。

图1 Na2SO4 用量对生物碱提取率的影响

3.1.2 PEG1000 用量对生物碱提取率的影响 从图2 可以看出，随着PEG1000 质量分数的增加，生物碱提取率逐渐增加，在30%时，提取率达到最高，之后提取率出现下降，故选择PEG1000 的用量在20% ～40%为宜。

3.1.3 料液比对生物碱提取率的影响 从图3 可以看出，随着料液比的增加，生物碱提取率随之增加。在料液比1 ∶30 时，生物碱提取率达到最高，之后生物碱提取效率出现下降，故选择料液比在1 ∶40 ～1 ∶20 为宜。

3.1.4 超声时间对生物碱提取率的影响 随着超声时间的增加，生物碱提取率不断增加，在40 min 前增加较为明显;在50 min 时，生物碱含有量达到最高;50 min 后，生物碱提取率变化不大，趋近平行。观察供试液发现，随着提取时间的延长，色泽加深。考虑到超声时间过长，温度会有所升高，可能对生物碱的结构有一定的影响，且从缩短工时节省能源而得到较高的提取效率角度来考虑，选择超声时间50 min 为宜。

图2 PEG1000 用量对生物碱提取率的影响

图3 料液比对生物碱提取效率的影响

3.2 响应面法优化百部中生物碱提取工艺 对百部生物碱提取工艺进行响应面分析的具体试验方案及实验结果见表1。15 个试验分为析因点和零点，试验号1 ～12 是析因试验，13 ～15 是中心试验。其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维定点，零点区域为中心点，零点试验重复3 次，以估计试验误差。

表1 响应面分析方案及试验结果

采用Design Expert 7.1.6 软件对中心组合试验数据进行回归分析的结果见表2。以百部生物碱提取率为响应值，经回归拟合后，得到回归方程

表2 RSM 分析拟合回归方程的方差分析

响应曲面图和剖面图是响应值对各试验因子V、P、t所构成的响应面图形，从响应面分析图上可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用，剖面图的形状反映出两因素交互作用的强弱，图中等高线越趋向于椭圆，则反映出两因素交互作用越强［11］。由图4 ～图6 可较为直观地看出各因素对百部中生物碱提取效率的影响，曲线越陡峭，表明该因素对百部生物碱提取效率的影响越大，响应值的变化亦愈大。由等值线图可以看出存在极值的条件在圆心区域。对回归方程求一阶偏导数代入变换公式即得最佳提取条件PEG1000 质量分数32.4%，Na2SO4质量浓度0.353 g/mL，料液比1 ∶27.5，此条件下百部生物碱含有量预测值为9.09 mg/g。在此条件下进行3 次平行验证试验，得到总生物碱含有量9.01 mg/g，与理论预测值吻合良好。

3.3 不同提取方法的比较 将本法与常规回流提取方法进行比较研究，常规回流提取法提取百部中总生物碱含有量为7.21 mg/g，小于聚乙二醇1000 (PEG1000)/无水Na2SO4双水相组合在最佳提取条件下对对叶百部的生物碱的提取率。结果表明，超声耦合聚乙二醇 1000(PEG1000)/无水Na2SO4双水相体系用于提取百部中的生物碱，不仅用时短，常温下可进行，避免了某些活性成分因高温分解而损失，而且生物碱得率也高于常规方法，证明了超声耦合双水相体系的优越性，具有一定的实用价值。

图4 硫酸钠(A)与PEG1000 用量(B)对生物碱提取效率影响的曲面图和剖面图

图5 硫酸钠用量(A)与料液比(C)对生物碱提取效率影响的曲面图和剖面图

图6 PEG1000 用量(B)与料液比(C)对生物碱提取率影响的曲面图和剖面图

4 讨论

本实验通过单因素试验考察了PEG1000 用量、Na2SO4用量、液料比和超声时间对百部生物碱提取效率的影响，确定了进一步试验的范围，再应用响应面分析法对各因素的最佳水平范围及其交互作用进行研究和探讨，建立了影响生物碱提取效率的二次多项数学模型，依据回归分析结果可知，百部生物碱提取的最佳条件为PEG1000 质量分数32.4%，Na2SO4质量浓度0.353 g/mL，料液比1 ∶27.5。采用此优化条件进行提取试验，与理论预测值相符。

PEG1000/Na2SO4双水相体系中，生物碱分配于上相有机相，而其他水溶性成分则分配于盐水下相中，从而在提取的同时也实现了生物碱与某些无效成分如糖类等的分离，有效提高了产物的纯度。另外，在提取过程中，生物碱转移至PEG1000 相，可改变提取过程中的化学平衡，有利于更多生物碱的溶出。实验研究表明，与传统的加热回流法相比，超声辅助提取与PEG1000/Na2SO4双水相体系可方便实现集成，并能缩短提取时间、提高效率，降低提取温度，避免了某些活性成分因高温分解而损失，从而获得了高纯度和活性的生物碱。该提取工艺在百部活性成分的提取分离方面展现了良好的应用前景。

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