HP-20 型大孔吸附树脂对土茯苓总黄酮的富集纯化作用

王 敏， 陈文龙， 王志仁， 卢传礼， 朱 伟*

(1. 广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州510000;2. 北京回龙观医院，北京100096)

土茯苓是百合科植物光叶菝葜Smilax Glabra Roxb 的干燥根茎，具有解毒除湿，通利关节之功效［1］，该植物资源丰富，分布广泛，主产于广东、湖南、四川、安徽、浙江、湖北等地。近年来临床和药理实验表明，它在免疫调节、抗炎、抗菌、抗癌、抗动脉硬化和治疗冠心病等［2-4］具有良好的效果。土茯苓中含有黄酮、皂苷、鞣质、树脂、淀粉及有机酸等化学成分，其中黄酮类成分落新妇苷、花旗松素等［5］具有重要的生理活性。本实验应用紫外分光光度法和UHPLC-LTQ-Orbitrap 液质联用技术，以土茯苓总黄酮为目标物，考察了HP-20 型大孔树脂对土茯苓中黄酮类成分的富集纯化作用。

1 材料

1.1 药材 土茯苓(康美药业股份有限公司，批号121205271)，经广东省中医院中药制剂实验室袁小红研究员鉴定为百合科植物光叶菝葜Smilax Glabra Roxb 的干燥根茎。然后，将药材进行干燥、粉碎，过50 目筛，避光保存备用。

1.2 仪器与试剂 U-2910 紫外双光束分光光度计(日本Hitachi 公司);LTQ-Orbitrap XL 组合式高分辨质谱仪、Accela 超高压液相色谱仪(美国Thermo Fisher 公司);B600A型离心机(安新县白洋离心机厂);BT125-D、BS224-S 电子分析天平(精度分别为十万分之一、万分之一，德国赛多利斯公司);Millipore 纯水机(美国密理博公司)。HP-20 大孔吸附树脂(日本三菱化学公司)。芦丁对照品(成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥99%)。甲醇为色谱纯(美国迪马公司);其他试剂均为分析纯;超纯水(自制)。

2 方法与结果

2.1 土茯苓粗提取物的制备 取土茯苓粉末100 g，置于2 000 mL 圆底烧瓶中，70%乙醇加热回流，提取3 次，第1 次提取2.5 h，第2 和第3 次提取2 h，4 000 r/min 离心20 min，过滤，取上清液，合并后减压回收溶剂，浓缩蒸干，称定质量，4 ℃下避光保存备用(该乙醇粗提取物编号为TFL-Z)。

2.2 总黄酮的富集

2.2.1 树脂的预处理 将HP-20 型树脂用95%乙醇浸泡24 h，充分溶胀后用乙醇洗至加适量水时无白色浑浊现象产生，再改用大量水洗至无醇味，备用。

2.2.2 大孔吸附树脂分离土茯苓中的总黄酮 取TFL-Z 适量，蒸馏水100 mL 充分溶解，离心15 min (3 000 r/min)，取上清液，上HP-20 型大孔吸附树脂柱 (40 mm × 340 mm)，用水、30%、60%、95%乙醇梯度洗脱，分别收集各梯度约5 倍于柱体积的洗脱液，减压回收溶剂，浓缩蒸干，称定质量，4 ℃下避光保存备用(分别编号为TFL-1、TFL-2、TFL-3、TFL-4)。

2.3 总黄酮测定 采用NaNO2-A1 (NO3)3-NaOH 比色法［6］，以芦丁为对照品，试样中加入铝离子试剂，同时调整适当的pH，使黄酮类物质与铝离子形成络合物，在可见光区获得稳定的特征吸收峰，然后进行比色法测定。

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品0.005 g，70%乙醇溶解，定容至25 mL，摇匀，即得对照品溶液(质量浓度为0.2 mg/mL)，4 ℃下避光保存。然后，70%乙醇稀释成质量浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL 的溶液。

2.3.2 方法学考察

2.3.2.1 线性关系 分别精密吸取“2.3.1”项下稀释的各质量浓度的对照品溶液2 mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加入4%氢氧化钠溶液4 mL，摇匀，放置10 min。然后，采用紫外分光光度计法，在500 nm 波长处测定其吸光度值，每组平行3 次，以吸光度为纵坐标(Y)，以芦丁质量浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，进行回归计算。结果得到回归方程Y =2.599 1 X -0.015 2(r=0.999)，表明芦丁在0.025 ～0.2 mg/mL 质量浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.3.2.2 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液2 mL，置于10 mL 量瓶中，按“2.3.2.1”项下实验方法进行显色和吸光度测定，计算含有量。结果，测得总黄酮的平均含有量为89.95 μg/mL，RSD 为0.94%，表明该仪器精密度良好。

2.3.2.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液2 mL，置于10 mL 量瓶中，按“2.3.1”项下方法操作，显色后分别放置10、20、30、40、50、60 min，测定吸光度。结果总黄酮的平均含有量为89.88 μg/mL，RSD 为0.75%，表明供试品溶液在显色后1 h 内的稳定性良好。

2.3.3 不同组分中总黄酮含有量的测定 分别称取TFLZ、TEL-1、TFL-2、TFL-3、TFL-4 适量，70% 乙醇溶解稀释，摇匀，使其质量浓度为2 ×10-4g/mL，再精密吸取待测样品溶液2 mL，按“2.3.2.1”项下方法测定样品的吸光度，计算出样品中总黄酮的含有量。结果表明，土茯苓经70%乙醇提取后，粗提物中总黄酮的含有量为42.22%，而经HP-20 型大孔吸附树脂纯化后，其含有量明显提高，达66.91%，比纯化前提高了1.5 倍左右，而且其总黄酮的转移率达63.39%。

2.3.4 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件计算各组数据的平均数与标准差，实验结果以±s 表示，t 检验进行非配对显著性分析，结果见表1。

表1 土茯苓粗提取物及各乙醇梯度洗脱物中的总黄酮含有量

同时还发现，土茯苓不同组分中总黄酮的含有量存在一定差异。粗提取物经HP-20 型大孔树脂层析后，水(TFL-1)和95%乙醇(TFL-4)洗脱组分中的总黄酮含有量较低，而该成分主要富集于30% (TFL-2)和60%(TFL-3)乙醇洗脱组分，并且在TFL-2 中的含有量最高。另外，TFL-2 和TFL-3 中总黄酮的含有量明显高于未经大孔吸附树脂富集的TFL-Z (P ＜0.01)，差异具有统计学意义，表明HP-20 型大孔树脂能有效地富集土茯苓中的总黄酮，并与乙醇体积分数相关。

2.4 液质联用技术分析总黄酮成分［7］采用高分辨质谱与超高压液相色谱(UHPLC)联用方法，对黄酮类成分进行快速分析与鉴定。称取TFL-Z 适量，50%甲醇溶解，过滤，定容至5 mL，过0.22 μm 滤膜备用。

2.4.1 色谱条件 色谱柱为菲罗门kinetex (2.1 mm ×100 mm，1.7 μm);流动相为甲醇-0.3%甲酸水溶液，梯度洗脱(0 ～30 min，15% ～95%甲醇);体积流量300 μL/min;检测波长295 nm;柱温30 ℃;进样体积5 μL。

2.4.2 质谱条件 采用电喷雾离子源，ESI 负离子模式;鞘气42 单位;辅助气8 单位;喷雾电压3.0 kV;毛细管温度350 ℃;管透镜电压-86 V;毛细管电压-35 V;样品先采用FT 进行全扫描，扫描范围m/z 150 ～1 500，分辨率30 000;二级和三级质谱采用动态数据依赖性扫描(data dependent scan，DDS);分辨率15 000;碰撞能量25% ～35%;选取上一级最高峰进行碰撞诱导解离(CID)碎片扫描;离子阱打拿极(dynode)检测。

2.4.3 色谱图分析 按照“2.4.1”项下色谱条件，取TFL-Z、TFL-1、TFL-2、TFL-3、TFL-4 适量，分别进样分析，得到相应色谱图，见图1。

图1 土茯苓粗提取物及各梯度洗脱物的重叠色谱图(295 nm)

实验发现，采用UHPLC 进行分析，结合HP-20 型大孔树脂制备TFL-1、TFL-2、TFL-3、TFL-4 时所得的指纹图谱成分信息多于TFL-Z。由文献［8］可知，土茯苓中落新妇苷的特征信号峰明显，而TFL-Z 色谱图(图1)中最高的信号峰即为落新妇苷，与该文献报道一致。然后，以未经HP-20 型大孔树脂层析的TFL-Z 图谱作为对照，结果显示TFL-1 图谱中的峰低矮无序，无TFL-Z 中的特征峰;TFL-2和TFL-3 图谱中的特征峰比TFL-Z 明显，峰面积更大，而且两者可追踪TFL-Z 中所有明显的信号峰;TFL-4 图谱中无明显特征峰，大多是矮峰或小的“馒头峰”，表明HP-20型大孔树脂对土茯苓有效成分的富集纯化作用较明显，主要集中在30% (TFL-2)和60% (TFL-3)乙醇洗脱组分(TFL-2、TFL-3)中。

2.4.4 质谱数据结果与分析 由于土茯苓中的黄酮类成分含有较多酚羟基，属于酸性化合物，在负离子模式下响应值明显，而且该模式下只有［M-H］-离子峰，故选择负离子模式检测土茯苓。按“2.4”项下色谱条件，对TFL-Z进行分析，结果见图2。其中，在图2A 所示的ESI-MS 负总离子流图中，显示出17 个土茯苓色谱信号峰;在图2B所示的UHPLC-PDA 图中，295 nm 下各色谱峰之间实现了较好的分离。

图2 TFL-Z 的ESI-MS 负总离子流图(A)和UHPLC-PDA 图(B)

另外，通过分析各主要UHPLC 峰与总离子流图中所对应离子峰的质谱信息，并结合一级质谱扫描检测出的准分子离子峰，用于确定分子量，并根据高分辨质谱信息来推断其元素组成。然后，通过二级质谱扫描得到的碎片信息，对准分子离子峰进行结构分析，同时结合文献［8-13］，推测其对应的化学成分归属，见表2。结果，初步鉴定出17个土茯苓中的化学成分，主要为二氢黄酮类化合物。

表2 质谱数据的分析结果

在图2A 中，化合物2 和4 的［M-H］-m/z 均为289.070 7 (C15H13O6)，并给出了相同的碎片离子m/z 245、205 和179.034，说明两者为同分异构体;化合物5、6、7的［M-H］-m/z 均为335.076 1 (C16H15O8)，两者分子式相同，并具有相同的二级碎片离子;化合物10、12、13、14 的［M-H］-m/z 均为449.107 8 (C21H21O11)。另外，分子离子峰均为451.102 4，并具有相同分子式C24H19O9的化合物有3 个;同为433.112 9 的化合物有2 个，而且两者的二级质谱也基本一致，表明为同分异构体。通过高分辨碎片离子信息、各化合物在UHPLC 分析中所对应色谱峰的保留时间以及总离子流中的信号差异等数据，并与文献报道的色谱保留行为和质谱裂解进行比较，可初步推断化合物2 和4，5、6 和7，8 和11，10、12、13 和14，15 和17 分别为儿茶素和表儿茶素［14］，3-O-咖啡酰莽草酸、4-O-咖啡酰莽草酸和5-O-咖啡酰莽草酸［8］，辛可耐因Ia 和辛可耐因Ib［13］，落新妇苷、异落新妇苷、新落新妇苷和新异落新妇苷［11-12］，黄杞苷和异黄杞苷［9-10］。另外，化合物9 根据其波谱数据及文献［12］，推断为花旗松素，属于二氢黄酮醇类。

综上所述，土茯苓经HP-20 型大孔吸附树脂富集的化学成分主要是二氢黄酮类化合物，其含有量较高，而且成分种类较多，如落新妇苷、新落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷、黄杞苷及异黄杞苷等［9-12］，这与目前的文献报道相符。

3 讨论

目前，对土茯苓有效成分总黄酮的分离纯化工艺已有相关研究报道。吴新荣和黄少伟等［15-16］分别采用聚酰胺颗粒和D101 大孔吸附树脂进行工艺考察，结果显示，材料本身性质会影响分离纯化效果。其中，HP-20 三菱化学大孔吸附树脂作为一类新型高分子材料，以吸附量高、颗粒均匀、机械强度好、不易破碎、残留物少、预处理方便等优点而闻名世界。它为非极性物质，具有相当大的孔径，以聚苯乙烯为基体来吸附含有π 电子的化合物(如含有苯环和共轭双键的黄酮类成分)，而且普通有机溶剂、酸或碱等即可容易地洗脱被吸附物质。因此，HP-20 大孔吸附树脂在各领域得到广泛运用，特别适合分离黄酮、色素、皂苷类化合物。尚至春等［17］考察了其对南山茶花总黄酮富集纯化的工艺参数，证明它对该植物的总黄酮具有良好的富集纯化效果。

本实验根据黄酮类化合物易溶于强极性溶剂的性质，选择不同体积分数的乙醇进行梯度洗脱。结果发现，水和95%乙醇组分中的总黄酮含有量均很低，可能是由于水的极性大，导致其他杂质较多，而乙醇体积分数过高能使土茯苓总黄酮的溶解度降低，同时减弱了其与HP-20 型大孔吸附树脂分子间的作用力。土茯苓中的大部分总黄酮经大孔树脂富集层析后，主要集中在30% (TFL-2)和60%(TFL-3)乙醇洗脱组分中，其中在TFL-2 中的含有量最高。此外，TFL-2 和TFL-3 中总黄酮的含有量明显高于未经大孔吸附树脂富集的TFL-Z (P ＜0.01)，差异具有统计学意义，提示HP-20 型大孔树脂能有效地富集土茯苓中总黄酮。

同时，本实验采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色体系来测定总黄酮的含有量［6］。结果表明，该方法显色稳定，精密度和准确度满足含有量测定要求，而且操作简便，是目前应用最广泛的总黄酮含有量测定方法。然而，该方法进行测定时存在一些影响因素，如某些具有邻二酚羟基结构的化合物(含多羟基的酚酸、咖啡酸、绿原酸等)也会和铝离子络合显色。因此，在30%乙醇洗脱组分中测得芦丁为1 340.77 mg/g 的原因可能是HP-20 型大孔吸附树脂不仅富集了土茯苓中的黄酮类成分，同时也富集了部分酚酸和有机酸类化合物，导致总黄酮含有量的测定值偏高。所以，本实验采用液质联用技术来深入研究土茯苓各组分黄酮的富集效果，通过对这些成分进行化学指认和初步鉴定，进一步明确了TFP-2 和TFL-3 为HP-20 型大孔树脂富集的总黄酮馏分。

近几年来，随着质谱新技术的发展，线性离子阱的多级质谱功能和Orbitrap 高分辨质谱结合，形成液质联用技术(UHPLC-LTQ-Orbitrap)，它既避免了传统的先分离单体成分再做结构鉴定的繁琐过程，又可简便快速地获得各化合物的分子结构信息，显著提高了对中药中复杂化学成分的快速鉴定与分析效率。本实验利用该技术对土茯苓中的化学成分进行分离，建立相关质谱数据库，然后根据精确相对分子质量和多级质谱碎片信息，并结合相关文献报道，从其主要信号峰中快速辨认了17 个化合物的归属。其中，儿茶素、表儿茶素、花旗松素、落新妇苷、异落新妇苷、新落新妇苷、新异落新妇苷、黄杞苷、异黄杞苷这9 个化合物均为黄酮类成分，而且落新妇苷、黄杞苷及其同分异构体的信号峰面积较大，表明二氢黄酮类化合物在土茯苓中的含有量较高。因此，该技术从波谱数据分析鉴定方面，证明了经HP-20 型大孔树脂富集的化学成分即为土茯苓中的黄酮类化合物，并且与紫外分光光度法测定结果一致。

综上所述，本实验采用紫外分光光度法和液质联用技术，显示HP-20 型大孔吸附树脂能有效地对土茯苓中的总黄酮进行富集纯化，为开展进一步的相关研究提供了实验数据。

致谢

广州中医药大学徐文老师对论文撰写提供大力帮助，特此致谢!

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