肝癌复方对小鼠肝癌细胞移植瘤的抑制作用初探

孙 瀚， 范雪梅， 王义明， 王佩瑶， 孟宪生， 梁琼麟， 罗国安

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600；2.清华大学化学系，北京100084）

肝癌复方对小鼠肝癌细胞移植瘤的抑制作用初探

孙 瀚1， 范雪梅2*， 王义明2， 王佩瑶1， 孟宪生1， 梁琼麟2， 罗国安2*

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600；2.清华大学化学系，北京100084）

目的探讨肝癌复方及其组方单味药材对小鼠肝癌细胞移植瘤的抑制作用。方法建立小鼠肝癌H22细胞移植瘤模型，造模小鼠随机分组后干预给药，考察给药周期中小鼠体质量的变化并测量移植瘤质量，计算药物抑瘤率。结果肝癌复方组小鼠体质量变化最接近空白对照组，且肝癌复方的抑瘤效果最好，抑瘤率为53.85%，优于本实验所选择的两个阳性对照药环磷酰胺和斑蝥的抑瘤率 （分别为48.46%和17.69%）。结论肝癌复方对小鼠肝癌移植瘤具有较好的抑制作用，且副作用较小。本研究可为肝癌复方临床治疗应用提供实验依据。

肝癌复方；肝癌；H22细胞移植瘤模型；抑瘤率

肝癌是世界上常见的消化系统恶性肿瘤之一，高居恶性肿瘤排名榜的第五位，且世界各地肝癌发病率均有上升趋势［1-2］。肝癌是高度恶性、预后极差的肿瘤之一，未经治疗，一般生存期仅为1～4个月［3-4］。

肝癌复方是根据传统中医药临床经验，由水红花子、花蕊石、白茅根、薏苡仁四味中药组成的经验方，其中水红花子为君药。该方具有止痛止血、疏经通络、健脾祛湿、破症散结、祛瘀生新等功效，可舒缓肝癌患者临床症状，甚至减小肿瘤体积。因此本研究建立了小鼠肝癌H22细胞实体瘤移植模型，考察肝癌复方对肝癌的治疗作用。

1 材料及设备

1.1 细胞株及动物 小鼠肝癌H22细胞株，购自上海复蒙基因生物科技有限公司。雌性SPF级昆明种小鼠130只，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（京）2006-0009，于清华大学生物医学中心三层屏障环境小鼠IVC饲养系统饲养。1.2 药物 水红花子药材（产地广西，生产批号090901），薏苡仁药材（产地贵州，批号20090801），购自大连经济技术开发区保健大药房；花蕊石药材 （产地广西，生产批号080201），购自亳州市中药饮片厂；白茅根药材 （产地河北，批号20070601），购自大连市同仁堂药店；肝癌复方由上述药材组合经辽宁中医药大学药学院中心实验室加工而成；环磷酰胺注射剂（生产批号10042521），复方斑蝥胶囊（生产批号100805），购自北京肿瘤医院。

1.3 试剂及仪器 台盼蓝染料 （北京索莱宝科技有限公司，中国）；DMEM，胎牛血清（Gibco公司，美国），DMSO（Amresco公司，美国）。超纯水系统（Millipore公司，美国）；MCO-15AC二氧化碳培养箱（Sanyo公司，日本）；XDS-1B/XJP-6A相差显微镜（Olympus公司，日本）；台式冷冻离心机（Hettich公司，德国）。

2 实验方法

2.1 肝癌H22细胞小鼠腹水模型建立［5-7］取健康状态良好，已饲养3 d的SPF级昆明小鼠10只，于SPF级动物无菌操作平台中，无菌吸取肝癌H22细胞悬液0.2 mL，注射于小鼠腹腔。原代肝癌H22细胞小鼠接种后约7 d至10 d内可观察到腹部膨大，说明接种成功。无菌吸取接种7 d的小鼠肝癌H22细胞腹水混悬液，以无菌生理盐水按照1∶3比例稀释，另取SPF级昆明种小鼠，无菌吸取0.2 mL稀释后的肝癌H22细胞悬液注射入小鼠腹腔，进行传代。

2.2 小鼠肝癌H22细胞实体瘤模型的建立

2.2.1 肝癌H22细胞混悬液的制备及腋下移植瘤接种 传代3次，接种7 d，腹水长势良好的昆明小鼠，脱颈椎处死，利用碘酒、医用酒精对小鼠腹部皮肤进行消毒，无菌抽取腹水。台盼蓝染料对腹水中肝癌H22细胞进行活性检测和计数，细胞存活率应大于95%，计算腹水中细胞密度。以生理盐水稀释腹水，使细胞密度维持在1.0×107个/mL左右。随机选取10只小鼠作为空白组，对其余80只健康SPF级雌性昆明小鼠进行腋下移植瘤接种。碘酒、医用酒精消毒小鼠右腋下皮肤，牙科手术镊子提起小鼠右腋下皮肤，将0.2 mL稀释后的腹水溶液注射于小鼠右腋皮下，保证无腹水溶液渗出。

2.2.2 小鼠的分组、给药与饲养 小鼠接种腋下移植瘤后24 h，将80只接种昆明小鼠随机分成8组：模型组、西药阳性对照环磷酰胺组（2.000 mg/mL）、中药阳性对照斑蝥组（0.008 mg/mL）、肝癌复方组、水红花子组、薏苡仁组、花蕊石组、白茅根组，肝癌复方及其单味药均为40.909mg/mL，每组10只，另有10只空白组小鼠。9组小鼠每天定时灌胃给药，灌胃剂量为0.5 mL，每日2次，连续给药10 d。药物均用1μL/mLCMC-Na溶液溶解，空白对照组及模型组每次灌胃CMC-Na溶液。分别于给药后第3天、第6天、第10天称量小鼠体质量，监测其变化。

2.3 样本采集及指标测定 给药第9天禁食不禁水，次日，称量小鼠体质量，脱颈椎处死小鼠。用牙科手术镊子镊住小鼠右腋下肿瘤生长部位皮肤，以手术剪刀剪开小鼠皮肤，使移植瘤暴露出来，以牙科手术镊钝性剥离移植瘤。用生理盐水清洗瘤组织3次以除尽组织中的血液并采用滤纸吸去多余生理盐水，称量移植瘤质量，记录瘤质量。按如下公式计算各给药组的抑瘤率，采用SPSS软件对实验数据进行t检验，检验组间是否存在显著性差异。

各组抑制率 （%）=［1-（给药组平均瘤质量/模型组平均瘤质量）］×100%

3 实验结果

3.1 给药期间各组小鼠体质量变化趋势 小鼠体质量变化可以部分反映瘤质量的大小和药物副作用的大小，各组小鼠在给药第0天、给药第3天、给药第6天、给药第10天的体质量变化趋势如图1所示。各组小鼠在给药第0天到第6天体质量增长迅速，给药第6天到第10天体质量增长速度趋缓，甚至略微下降，处于体质量平衡期。其中肝癌复方组和花蕊石组在给药第6天到第10天体质量最接近空白对照组，说明其对小鼠体质量的影响较小。

图1 各组小鼠给药期间体质量变化趋势图

3.2 各组药物对小鼠移植瘤的抑制作用 各组小鼠实验前后体质量、瘤质量和抑瘤率如表1所示，与模型组相比，环磷酰胺组、肝癌复方组、水红花子组、白茅根组、花蕊石组小鼠的抑瘤率显著降低，说明上述5种药物对小鼠肝癌移植瘤具有抑制作用。肝癌复方的抑瘤作用最佳，抑瘤率达到53.85%，其次为肝癌复方中的君药水红花子，抑瘤率为49.23%。

4 讨论

复方因其与组方单味药相比具有增效减毒的优点，不仅是中药用药的主要形式［8-9］，也逐步被西方所接受。本研究建立小鼠肝癌H22细胞实体瘤移植模型，考察了肝癌复方及其组成单味药物对小鼠体质量及瘤质量的影响。

通过各组小鼠给药期间体质量变化趋势，发现小鼠体质量的增加可能与瘤质量的增加相关，肝癌复方组在给药第6天到第10天体质量最接近空白对照组，说明肝癌复方对移植瘤产生抑制作用较好。花蕊石组的小鼠在给药第6天到第10天体质量出现小幅下降，可能由于花蕊石为矿物类药材，含有镉 （Cr）、砷 （As）等有毒重金属元素较多［10］、毒性较强，导致小鼠体质量下降。而白茅根组的小鼠体质量在这一时期却呈现小幅度上升趋势，推测除瘤质量增加外，白茅根药材中的有效组分为白茅根多糖类成分，具有较强的免疫调节作用［11］并能为小鼠提供营养，也可使该组小鼠体质量增加。另外，环磷酰胺组小鼠体质量变化趋势有别于其他各组小鼠，且该组小鼠各段时期平均体质量均低于其他各组小鼠。推测其原因可能为环磷酰胺为烷化剂类抗肿瘤药物可通过干扰所有快速增生组织的细胞分裂而达到抑制恶性肿瘤的目的，但有较多文献报道环磷酰胺具有较强的心脏毒性［12］。有研究表明［7］环磷酰胺可能引起肝脏巯基和细胞色素P450含有量下降而导致肝脏毒性，推测由于环磷酰胺的较强毒性导致环磷酰胺组小鼠体质量低于其他各组，且其体质量变化趋势有别于其他各组小鼠。肝癌复方组小鼠体质量最接近空白组，说明其对小鼠的生长的影响最小。

表1 各组药物抑瘤率 （x±s，n=10）

从各给药组抑瘤率来看，肝癌复方抑瘤率高于临床证明有较好肝癌治疗作用的两个阳性对照组 （环磷酰胺组、斑蝥组）抑瘤率，说明肝癌复方对小鼠肝癌移植瘤具有较好的治疗作用。肝癌复方的抑瘤率高于其君药水红花子组，从增效性角度证明了中药复方配伍的必要性。水红花子组的抑瘤率高于其他各单味药组 （薏苡仁组、白茅根组、花蕊石组），从药理角度证明了水红花子在肝癌复方中的君药地位。

综上所述，肝癌复方可有效抑制小鼠肝癌细胞移植瘤，且副作用小。本研究可为肝癌复方后续深入研究及临床应用提供一定的实验依据。

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R285.5

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：1001-1528（2015）05-1091-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.037

2014-11-19

孙 瀚（1989—），男，硕士生，研究方向为中药学。Tel：18651535403，E-mail：sun.vic@foxmail.com

*通信作者：范雪梅（1981—），女，博士，高级工程师，研究方向为中药药理。Tel：（010）62781688，E-mail：xuemeifan@tsinghua.edu.cn罗国安（1946—），男，教授，研究方向为中医药系统生物学。Tel：（010）62772264，E-mail：luoga@tsinghua.edu.cn