地奥心血康抗炎镇痛作用实验研究

李 翔， 于 娅， 黄飞鸿， 熊 晏， 李奇娟， 瞿礼萍， 邹文俊

（成都中医药大学药学院，四川成都610075）

地奥心血康抗炎镇痛作用实验研究

李 翔， 于 娅， 黄飞鸿， 熊 晏， 李奇娟， 瞿礼萍， 邹文俊*

（成都中医药大学药学院，四川成都610075）

目的研究地奥心血康 （黄山药、穿龙薯蓣）的抗炎镇痛作用。方法采用福尔马林致小鼠疼痛反应模型、二甲苯致小鼠耳肿胀模型、醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高模型、棉球致小鼠肉芽肿模型和角叉菜胶致小鼠气囊炎症模型观察地奥心血康的抗炎镇痛作用；采用酶联免疫吸附法 （ELISA）硝酸还原法测定气囊炎症模型小鼠气囊灌洗液中肿瘤坏死因子 （TNF-α）和一氧化氮 （NO）水平，采用硫代巴比妥酸 （TBA）法和水溶性的四唑盐法 （WST-1）测定模型小鼠血清中丙二醛 （MDA）和超氧化物歧化酶 （SOD）水平，分析其可能的抗炎机制。结果地奥心血康80 mg/kg、60 mg/kg能显著减少福尔马林致痛模型小鼠15～35 min的舔后足累计时间（P＜0.05），能明显抑制二甲苯致小鼠耳肿胀、醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高、棉球致小鼠肉芽组织增生以及角叉菜胶致气囊炎症模型小鼠的炎症反应（P＜0.01或P＜0.05）；并能降低气囊炎症模型小鼠炎性渗出液中NO、TNF-α水平，减少血清中MDA水平，提高SOD活力（P＜0.01或P＜0.05）。结论地奥心血康的抗炎作用可能与抑制炎性因子NO、TNF-α及抗氧化有关。

地奥心血康；抗炎；镇痛；硫代巴比妥酸 （TBA）法

地奥心血康是地奥心血康胶囊的原料药，收载于 《中国药典》2010年版一部，为薯蓣科植物黄山药Dioscorea panthaica Prain et Burkill、穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino的根茎提取物［1］。地奥心血康胶囊是心血管领域中成药制剂，长期广泛用于治疗冠心病、心绞痛等心血管疾病，临床疗效显著。地奥心血康原料药材穿龙薯蓣具有 “祛风除湿、活血通络”的传统功效，民间应用于治疗风湿痹痛、肢体麻木、跌打损伤、痈肿等症［2-5］。近年来已有研究表明，穿龙薯蓣提取物具有一定的抗炎、镇痛作用［6-9］。然而，尚未见地奥心血康抗炎镇痛作用相关研究报道。本研究采用多种炎症和疼痛动物模型，观察地奥心血康的抗炎镇痛作用以及对炎症相关因子的影响，以初步阐明地奥心血康抗炎镇痛作用及可能的作用机制，为拓展地奥心血康的临床应用提供药理学依据。

1 材料

1.1 药物与试剂 地奥心血康 （棕色粉末，由成都地奥制药集团有限公司提供，批号20121227）；阿司匹林肠溶片 （拜耳医药保健有限公司，批号BJ08550）；二甲苯 （批号20110604）、冰醋酸 （批号20091008）、甲醛 （批号20120927）均由成都市科龙化工试剂厂生产。Evans Blue（Sigma公司，批号1001699862）；λ-角叉菜胶 （Sigma公司，批号17H1148）；SOD、MDA、NO试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；TNF-α试剂盒（RayBio公司，GA30092）。

1.2 动物 KM小鼠，SPF级，雄性，体质量18～22 g，由成都达硕生物科技有限公司提供，合格证号scxk（川）2013-24。动物饲养于标准环境：温度 （23±1）℃，相对湿度 （60±5）%，人工光照，12 h明暗周期交替，标准饲料喂养。

1.3 仪器 Sorvall ST-16R离心机（美国Thermo公司）；VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波长多功能读数仪 （美国Thermo公司）；BS323S电子天平（Sartorius公司）；101C-2电热鼓风干燥箱（上海实验仪器厂有限公司）。

2 方法

2.1 抗炎实验

2.1.1 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 取健康雄性KM小鼠60只，按体质量随机分为5组，每组12只，分别为模型组、阿司匹林组 （300 mg/kg）、地奥心血康高、中、低剂量组 （80、60、40 mg/kg）。连续灌胃给药5 d，每天1次，模型组给予等量蒸馏水。实验前动物禁食12 h，各组小鼠末次给药1 h后，用20μL二甲苯均匀涂抹于每只小鼠右耳前后两侧致炎，致炎后30 min处死小鼠，用直径6 mm小鼠耳片打孔器分别打下左右两耳同一部位，称定质量，根据公式计算小鼠耳肿胀度及耳肿胀抑制率。

耳肿胀度（mg）=右耳质量-左耳质量；

耳肿胀抑制率（%）=［（对照组耳肿胀度-给药组耳肿胀度）/对照组耳肿胀度］×100%。

2.1.2 对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响 取健康雄性KM小鼠60只，分组及给药方法同 “2.1.1”项，实验前动物禁食12 h，各组小鼠末次给药1 h后，尾静脉注射1%伊文思兰溶液0.1 mL/10 g体质量，同时腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL/只，于注射20 min后处死小鼠，用4 mL生理盐水冲洗腹腔，收集腹腔洗液，3 000 r/min离心15min，吸取上清液于590 nm处测定吸光度。以吸光度值反映小鼠腹腔毛细血管通透性的改变。

2.1.3 对棉球致小鼠肉芽肿的影响 取健康雄性KM小鼠60只，小鼠左下肢皮肤用75%酒精消毒后用镊子将棉球［（10±1）mg，高压灭菌，硫酸庆大霉素加无菌生理盐水润湿］沿皮下植入右上肢腹股沟处，用碘伏对伤口进行消毒。植入棉球后第2天小鼠按体质量分层随机分为5组，每组12只，分组方法同 “2.1.1”项，连续灌胃给药7 d，每天1次。实验前动物禁食12 h，各组小鼠末次给药1 h后，处死小鼠，解剖取出带肉芽组织的棉球，电子天平精密称取其质量 （湿质量），减去棉球的质量 （10 mg）后得到湿肉芽组织净质量，然后将肉芽组织置于80℃的烘箱中4 h，称定，计算肉芽肿干质量及抑制率。

肉芽肿干质量（g）=烘干棉球质量-0.01 g；

抑制率 （%）=［（模型组肉芽肿干质量-给药组肉芽肿干质量）/模型组肉芽肿干质量］×100%。

2.1.4 对角叉菜胶致小鼠气囊炎症模型的影响取健康雄性KM小鼠72只，按体质量随机分为6组，每组12只，分别为空白组、模型组、阿司匹林组 （300 mg/kg）、地奥心血康高、中、低剂量组 （80、60、40 mg/kg）。第1天给药前于小鼠背部肩胛区皮下无菌注入空气5 mL形成气囊，连续给药7 d，第4天和第6天补充注射空气3mL维持气囊膨胀，末次给药1 h后除正常组外其他小鼠在气囊内注入1%角叉菜胶1 ML，立即将鼠背向下徐徐转动，正常组囊内注入等容量生理盐水。致炎6 h后小鼠眼眶取血，3 000 r/min低速离心10min，分离血清，按试剂盒说明书采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法和水溶性的四唑盐（water-soluble tetrazoliuMsalt，WST-1）测定SOD、MDA水平；用75%酒精消毒背部皮肤，剪开气囊，以PBS缓冲液4 ML灌洗气囊，收集灌洗液并测量体积，加细胞稀释液后对其中白细胞进行计数；将灌洗液3 000 r/min低速离心10 min，收集上清液，2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠（bicinchoninic acid，BCA）法测定上清液中总蛋白量，用硝酸还原法检测NO量，ELISA法检测TNF-α量。

2.2 镇痛实验对福尔马林致小鼠疼痛反应模型的影响 取健康雄性KM小鼠60只，分组及给药方法同 “2.1.1”项，实验前动物禁食12 h，各组小鼠末次给药1 h后，将小鼠提前30 min放入烧杯中适应环境，在小鼠右后足跖部皮下注射5%福尔马林溶液20μL并计时，立即将小鼠单只放入直径20 cm的大烧杯内，记录Ⅰ相神经疼痛期 （0～5 min）和Ⅱ相炎性疼痛期 （15～35 min）小鼠舔右后足的累计时间。

2.3 统计方法 各组数据均用x±s表示，采用SPSS 17.0单因素方差分析（One-Way ANOVA），不符合者采用非参数检验秩和法分析。

3 结果

3.1 抗炎实验结果

3.1.1 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 与模型组比较，阿司匹林组和地奥心血康80、60 mg/kg剂量组能显著降低二甲苯所致小鼠耳肿胀度 （P＜0.01或P＜0.05），并呈现一定的剂量依赖性；低剂量组40 mg/kg有一定的作用趋势。见表1。

3.1.2 对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

与模型组比较，地奥心血康80、60 mg/kg剂量组能明显降低腹腔灌洗液OD值 （P＜0.05），地奥心血康40 mg/kg剂量有一定的作用趋势。见表2。

表1 地奥心血康对二甲苯致小鼠耳肿胀实验的影响 （x± s，n=12）Tab.1 Effect of DAXXK on Mice ear swelling caused byxy lene（x±s，n=12）

表2 地奥心血康对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 （x± s，n=12）Tab.2 Effect of DAXXK on Mice’s capillary permeability in abdoMinal cavity increased by acetic acid（x± s，n=12）

3.1.3 对小鼠棉球肉芽肿的影响 与模型组比较，地奥心血康80 mg/kg剂量组可显著降低棉球诱导的肉芽肿干质量 （P＜0.05）；地奥心血康60、40 mg/kg剂量组无显著抑制作用。见表3。

表3 地奥心血康对小鼠棉球诱导肉芽肿实验的影响 （x± s，n=12）Tab.3 Effect of DAXXK on Mice granuloma induced w ithcotton pellet（x±s，n=12）

3.1.4 对角叉菜胶致小鼠气囊炎渗出液中白细胞和总蛋白的影响 与空白组比较，模型组炎性渗出液中总蛋白和白细胞数目明显增多 （P＜0.05）。与模型组比较，地奥心血康80、60 mg/kg剂量组可显著降低小鼠炎性渗出液中总蛋白含有量和白细胞数目（P＜0.05），地奥心血康40 mg/kg剂量组无明显作用。见表4。

表4 地奥心血康对小鼠炎性渗出液中总蛋白和白细胞的影响（x±s，n=12）Tab.4 Effect of DAXXK on total protein and WBC on inflammation induced by carrageenan in theMice air pouch model（x±s，n=12）

3.1.5 对角叉菜胶致小鼠气囊炎炎症因子及SOD、MDA的影响 与空白组比较，模型组炎性渗出液中NO和TNF-α水平明显增高，血清中MDA水平显著增高，SOD活力明显下降 （P＜0.05）。与模型组比较，地奥心血康80 mg/kg剂量组可显著降低气囊炎小鼠炎性渗出液中NO水平，地奥心血康80、60 mg/kg剂量组可显著降低炎性渗出液中TNF-α的水平，同时可降低模型小鼠血清中MDA水平，提高SOD活力 （P＜0.05）。见表5。

3.2 镇痛实验结果 与模型组比较，地奥心血康80、60 mg/kg剂量组能显著减少福尔马林致痛模型小鼠15～35 min的舔后足累计时间 （P＜0.05），阿司匹林组及地奥心血康各剂量组均对0～5 min舔后足累计时间无明显影响。见表6。

表5 地奥心血康对小鼠气囊炎炎症因子及SOD、MDA的影响（x±s，n=12）Tab.5 E ffect of DAXXK on inflammatory cytokines and SOD、MDA on inflammation induced by carrageenan in theMice air pouch exudates（x±s，n=12）

表6 地奥心血康对福尔马林致小鼠疼痛的影响 （x±s，n=12）Tab.6 Effect of DAXXK on Mice pain induced by formalin（x±s，n=12）

4 讨论

地奥心血康胶囊是1989年国内批准上市的心血管领域中成药，该产品上市20多年来，已有大量基础及临床研究表明，地奥心血康具有扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、减慢心率、降低血压和外周阻力、降低心肌耗氧量、降低血液TC和TG水平、抗动脉粥样硬化、抑制血小板聚集、降低血液黏度等多方面的心血管相关药理作用和临床疗效［10-11］。本研究探讨并初步确认了地奥心血康在抗炎镇痛方面的药理活性，为该产品拓展与抗炎镇痛作用相关的临床新适应症提供了科学依据。

本研究通过二甲苯致小鼠耳肿胀和醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高两种急性炎症模型，角叉菜胶致小鼠气囊炎亚急性炎症模型和小鼠棉球肉芽肿慢性炎症模型，观察地奥心血康的抗炎作用；选择福尔马林致痛小鼠模型观察地奥心血康的镇痛作用。结果显示，地奥心血康80 mg/kg、60 mg/kg剂量组具有显著抑制二甲苯致小鼠耳肿胀、醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高、棉球致小鼠肉芽组织增生以及角叉菜胶致气囊炎症模型小鼠的炎症反应的作用，表明地奥心血康对急性非特异性炎症和慢性炎症均有良好抑制作用；同时地奥心血康80、60 mg/kg剂量组能显著缩短福尔马林致痛模型小鼠Ⅱ相炎性疼痛期 （15～35 min）舔足时间，而对Ⅰ相神经疼痛期 （0～5 min）舔足时间无影响，提示地奥心血康具有较明显抑制炎性疼痛的作用，而对神经性疼痛无作用，该镇痛作用特点类似非甾体抗炎药物阿司匹林 （阳性药物），但其抑制炎性疼痛的作用强度弱于阿司匹林 （300 mg/kg）。

NO是重要的炎性因子，调控炎症发生发展的每个关键步骤［12］；TNF-α是强有力促炎细胞因子，诱导白介素和次级炎症介质的合成，可加重局部的炎症反应［13］。同时，氧自由基也是炎症发生发展的重要病理机制之一［14］。本研究结果表明，地奥心血康能显著降低气囊炎小鼠炎性渗出液中NO和TNF-α水平，减少血清中MDA水平、提高SOD活力，提示地奥心血康可能通过抑制NO和TNF-α的合成和释放发挥抗炎作用，其抗炎作用与抗氧化作用有关。

本研究结果表明，小鼠抗炎镇痛作用有效剂量为80mg/kg、60mg/kg，地奥心血康治疗心血管疾病临床等效用量为5～10 mg/kg（地奥心血康胶囊每粒含地奥心血康100 mg，口服一次1～2粒，一日3次），地奥心血康抗炎镇痛的小鼠有效剂量与该产品临床治疗心血管疾病人用剂量基本一致。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：671-672.

［2］中国科学院林业土壤研究所.东北药用植物志［M］.北京：科学出版社，1959：40-41.

［3］山东中草药手册编写小组.山东中草药手册［M］.山东人民出版社，1970：235-237.

［4］河北省革命委员会商业局医药供应站.河北中药手册［M］.北京：科学出版社，1970：351-352.

［5］全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编：上册［M］.北京：人民卫生出版社，1975：571-572.

［6］庞晓东，林耀庚.穿地龙对角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀抗炎肿作用的观察［J］.天津中医，2002，19（5）：44-45.

［7］谢守军，宋鸿儒，彭兴荣.穿山龙总皂甙对佐剂性关节炎大鼠病理改变的影响［J］.四川中医，2007，25（8）：10-12.

［8］粘芙蓉，辛晓林.中药穿山龙镇痛实验研究［J］.中华中医药学刊，2009，27（8）：1644-1645.

［9］佟继铭，杨宇杰，石艳华，等.穿山龙地上部分和根茎总皂苷抗炎活性比较［J］.河北医学，2009，15（4）：381-383.

［10］朱友平，李伯刚.地奥心血康胶囊［M］.北京：科学出版社，2004：38-63.

［11］刘忠荣，邹文俊，王若竹，等.地奥心血康十年临床应用概述及疗效分析［J］.中国医药学报，2004，19（10）：620-622.

［12］Bryan N S，Bian K，Murad F.Discovery of the nitric oxide signaling pathway and targets for drug development［J］.Front Biosci，2009，1（14）：1-18.

［13］Elmali N，Baysal O，Harma A，etal.Effects of resveratrol in inflammatory arthritis［J］.Inflammation，2007，30（1-2）：1-6.

［14］Flora S J.Role of free radicals and antioxidants in health and disease［J］.Cell Mol Biol，2007，53（1）：1-2.

Anti-inflamMatory and analgesic effects of Diao Xinxuekang

LIXiang， YU Ya， HUANG Fei-hong， XIONG Yan， LIQi-juan， QU Li-ping， ZOUWen-jun*
（School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China）

AIMTo investigate the anti-inflammatory and analgesic effects of Diao Xinxuekang（Dioscorea Panthaica Prain et Burkill，Dioscorea nipponica Makino）（DAXXK）.METHODSThe anti-inflammatory and analgesic effects were performed on themice models for pain induced by formalin，of the ear swelling induced by xylene，for the capillary hyperpermeability in abdominal cavity induced by acetic acid，for the granuloma induced with cotton pellet，and for the air-pouch acute inflammation induced by carrageenan.The anti-inflammatorymechanismswere evaluated bymeasuring the levels of tumor necrosis factor（TNF-α）and nitric oxide（NO）in synovitis exudates determined by ELISA and nitrate reductase.Levels of SOD and MDA in seruMwere determined by watersoluble tetrazoliuMsalt（WST-1）and thiobarbituric acid（TBA）methods.RESULTSDAXXK（80，60 mg/kg）could reduce the cumulative time for licking hind at intervals of 15-35 min（P＜0.05）；lessen the xylene-induced ear edema，lower the capillary permeability in abdominal cavity and inhibitgranuloma，decrease the total protein contentand the amountofWBC in exudates（P＜0.01 or P＜0.05），reduce TNF-αand NO levels in exudates and MDA contents in serum，and increase SOD activity（P＜0.01 or P＜0.05）.CONCLUSIONDAXXK has remarkable anti-inflammatory and analgesic effects，which may be related to the inhibition of inflammatory cytokine NO and TNF-α，and antioxidant function.

Diao Xinxuekang（DAXXK）；anti-inflammatory；analgesic；thiobarbituric acid（TBA）method

R285.5

：A

：1001-1528（2015）05-0934-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.002

2014-10-12

国家科技部 “十二五”重大新药创制专项资助项目 （2012ZX09101231）

李 翔，硕士，研究方向为中药临床与应用。Tel：15828653810，E-mail：lx1990@139.com

*通信作者：邹文俊，博士，教授，研究方向为中药临床与应用。Tel：（028）82855465，E-mail：zouwenjun@vip.163.com