反相HPLC 法同时测定复方黄连素片中的8 种成分

陈燕军， 吴有根， 方海红， 金浩鑫， 魏惠珍

(1. 江西师范大学，江西 南昌330027;2. 南昌职业学院，江西 南昌330050;3. 江西科技师范大学，江西南昌330013;4. 中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西南昌330006)

复方黄连素片是中西药复方制剂，为《中国药典》2010 年版一部收载品种，具有清热燥湿、行气止痛、止痢止泻之功效，由盐酸小檗碱、木香、吴茱萸、白芍四味药组成。其中，盐酸小檗碱为主药，具有广谱抗菌作用;木香、白芍行气止痛，缓解脐周胀痛及痢疾里急后重，能抑制痢疾杆菌;吴茱萸温中散寒，并制黄连之苦寒［1-3］。

目前，现行标准［2］仅采用盐酸小檗碱和芍药苷作为复方黄连素片的质量控制指标，而无木香和吴茱萸的定量分析。因此，为了更好地评价该药物的质量，本实验参考文献［4-11］，建立了同时测定8 个指标性成分芍药苷、芍药内酯苷、盐酸小檗碱、吴茱萸内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、木香烃内酯和去氢木香内酯的方法。经验证，该方法简便、准确、重复性好，可为全方面、多指标评价复方黄连素片的质量提供一种思路。

1 仪器与试药

岛津LC10-AT HPLC 色谱仪;AUW-220D 型电子天平(日本岛津公司);梅特勒AB-104N 型电子天平(瑞士Mettler-Toledo 公司)。

对照品芍药苷(批号110727-201438)、盐酸小檗碱(批号110713-201212)、吴茱萸内酯(批号110800-201205)、吴茱萸碱 (批号110802-201409)、吴茱萸次碱(批号110801-201207)、木香烃内酯(批号111524-201208)、去氢木香内酯(批号111525-201209)均购自中国食品药品检定研究院;芍药内酯苷对照品(批号20130901，纯度≥97%)购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心。复方黄连素片购自市场(批号分别为140811、140915、141013)。乙腈为色谱纯(德国Merck 公司);磷酸二氢钾为分析纯(国药集团化学试剂有限公司);水为超纯水(自制)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 月旭XB-C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈(A)-0.03 mol/L磷酸二氢钾水溶液(B)，梯度洗脱(0 ～10 min，18% ～20%A;10 ～15 min，20% ～25%A;15 ～30 min，25% ～45%A;30 ～50 min，45% ～60%A;50 ～60 min，60% ～70% A);体积流量1.0 mL/min;柱温25 ℃;检测波长220 nm。

2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取芍药内酯苷、芍药苷、盐酸小檗碱、吴茱萸内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、木香烃内酯和去氢木香内酯对照品适量，加80% 甲醇溶液制成质量浓度分别为26.8、40.2、66.4、16.8、17.3、15.6、23.8、26.4 μg/mL 的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取样品适量，研细，精密称取0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，称定质量，超声(250 W、40 kHz)30 min，放冷，80%甲醇溶液补足减失质量，摇匀，滤过，滤液用于测定除盐酸小檗碱以外的其他成分，即得。再精密量取续滤液2 mL，置于100 mL 量瓶中，80%甲醇稀释至刻度，摇匀，用于测定盐酸小檗碱。

2.4 阴性样品溶液的制备 分别取不加白芍、木香、吴茱萸、盐酸小檗碱的阴性样品适量，按“2.3”项下方法配制阴性样品溶液，即得，HPLC色谱图见图1。

2.5 线性试验 分别取混合对照品溶液2、5、10、15、20、25、30 μL，注入HPLC 色谱仪中分析，记录色谱峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，进样量(μg)为横坐标(X)，得到芍药内酯苷、芍药苷、盐酸小檗碱、吴茱萸内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、木香烃内酯、去氢木香内酯的回归方程。分别为Y =2 859 499X -10 196，r =0.999 6;Y=4 886 426X+6 188，r=0.999 9;Y=2 567 287X-6 883，r=0.999 7;Y=494 034X-277，r=0.999 9、Y=8 149 519X-10 112，r=0.999 5;Y=2 600 093X+1 352，r = 0.999 8;Y = 2 108 095X + 1 332，r =0.999 6;Y=2 734 223X +4 571，r =0.999 8。并且各成 分 在0.054 ～0.804 μg、0.080 ～1.21 μg、0.132 ～1.99 μg、0.034 ～0.504 μg、0.035 ～0.519 μg、0.031 ～0.468 μg、0.048 ～0.714 μg、0.053 ～0.792 μg 范围内的线性关系均良好。

图1 HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.6 精密度试验 取供试品溶液(批号140915)适量，重复进样6 次，每次10 μL，记录色谱峰面积。结果，芍药内酯苷、芍药苷、盐酸小檗碱、吴茱萸内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、木香烃内酯、去氢木香内酯的峰面积RSD 分别为1.4%、1.8%、0.79%、1.0%、1.8%、0.56%、1.2%、1.3%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 精密称取复方黄连素片(批号140915)6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下分析测定。结果，芍药内酯苷的含有量为1.94 mg/g，RSD 为2.0%;芍药苷的含有量为2.42 mg/g，RSD 为2.0%;盐酸小檗碱的含有量为101.2 mg/g，RSD 为1.3%;吴茱萸内酯的含有量为1.40 mg/g，RSD 为1.5%;吴茱萸碱的含有量为0.58 mg/g，RSD 为0.72%;吴茱萸次碱的含有量为0.56 mg/g，RSD 为1.1%;木香烃内酯的含有量为1.08 mg/g，RSD 为0.88%;去氢木香内酯的含有量为2.34 mg/g，RSD 为0.64%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取各成分含有量已知的复方黄连素片 (批号140915)6 份，每份0.25 g，分别加入芍药内酯苷、芍药苷、吴茱萸内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、木香烃内酯、去氢木香内酯混合对照品溶液适量，以及盐酸小檗碱对照品约25 mg，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，计算加样回收率，结果见表1，表明该方法回收率良好。

2.9 样品测定 精密称取复方黄连素片0.5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行测定，结果见表2。

3 讨论

在供试品的制备方法中，本实验考察了60%、80%、90%甲醇溶液及超声处理20、30、40 min时的提取效果。结果表明，80%甲醇溶液、超声处理30 min 时就可有效提取样品中的待测成分。

表1 加样回收率试验结果Tab.1 Result of recovery tests

表2 复方黄连素片中8 种成分的含有量(mg·g -1，n=3)Tab.2 Contents of eight constituents in Compound Huangliansu Tablets (mg·g -1，n=3)

另外，样品中盐酸小檗碱的含有量明显高于其他7 种成分，无法同时测定。而如果将样品稀释50 倍后，则在同样色谱条件下，可准确测定盐酸小檗碱的含有量。

本实验将《中国药典》2010 年版复方黄连素片中测定盐酸小檗碱和芍药苷的色谱条件与样品的制备方法作了统一，同时测定了该药物中其他6 个有效成分，有利于复方黄连素片的质量控制，为提高其质量标准提供了一种新的方法。

［1］ 林 林，林永强，汪 冰，等. HPLC 波长切换技术同时测定复方黄连素片中6 个成分的含量［J］. 药物分析杂志，2014，34(1):96-99.

［2］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典:2010 年版一部［S］. 北京:中国医药科技出版社，2010:923.

［3］ 李玉恒，张振秋，赖静怡，等. HPLC 波长切换技术同时测定萸连片中7 种成分含量［J］. 药物分析杂志，2011，31(2):371-375.

［4］ 伍振峰，傅声玲，胡鹏翼，等. HPLC 法同时测定戊己方提取物中5 个成分的含量［J］. 药物分析杂志，2013，33(6):950-954.

［5］ 张敏娟，黄秀梅，姜世贤，等. HPLC 和UPLC 法测定复方黄连素片中吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量的方法比较［J］.药物分析杂志，2012，32(11):2077-2081.

［6］ 丁世兰，崔元璐，张 叶，等. 切换波长HPLC 同时测定左金丸乙醇提取物中7 种生物碱的含量［J］. 中国实验方剂学杂志，2012，18(15):66-70.

［7］ 宋亚芳，王智民，朱晶晶，等. 一测多评法测定吴茱萸中吴茱萸内酯、吴茱萸碱及吴茱萸次碱的含量［J］. 中国中药杂志，2009，34(21):2781-2785.

［8］ 吴永芹，赵新静，阎道辉，等. HPLC 法测定复方黄连素片中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量［J］. 齐鲁药事，2009，28(10):596-598.

［9］ 刘晓哲，张东方. HPLC 同时测定复方黄连素片中3 种成分的含量［J］. 中国实验方剂学杂志，2014，20(1):70-73.

［10］ 黄山君，杨琪伟，石燕红，等. 一测多评法测定白芍中芍药苷与芍药内酯苷的含量［J］. 中国中药杂志，2011，36(6):780-783.

［11］ 李捷玮，金柔男，李 翔，等. 多种中成药中芍药苷的含量测定［J］. 药物分析杂志，2009，29(9):1440-1443.