心肺复苏对室颤大鼠脑线粒体功能保护作用的研究

罗燕玲 蒋龙元 符岳

心跳骤停是临床常见的急危重症，心跳骤停后心肺复苏初期自主循环恢复(ROSC)成功的患者存活率低，只有1.4%～5%能相对正常生存出院[1]。在发生心跳骤停时，心脏血供完全中断，予以高质量的CPR后，也仅能提供正常心肌血流灌注水平的10%～20%[2-3]。本实验通过电刺激致颤法建立大鼠心肺复苏模型，从线粒体水平研究全脑缺血后CPR对缺血缺氧后脑功能的保护作用。

材料与方法

一、实验材料

由中山大学实验动物中心提供(许可证号：scxk粤2004-0011)的SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重450～550 g。

二、方法

1.动物准备与脑线粒体的分离： 应用心搏骤停和心肺复苏装置[4-5]建立大鼠心跳骤停与心肺复苏模型。 成年健康雄性SD大鼠24只，随机分为3 组，每组8只大鼠。SD大鼠术前晚禁食，予戊巴比妥钠浓度(45 mg/kg) 腹腔内麻醉，备皮，仰卧位固定，经口直视插入气管鞘管。左股动脉置入23-0 PE-50 聚乙烯管监测主动脉压，右颈静脉置3F 鞘管送入前端弯曲的指引钢丝到达右心室内膜，皮下插入针头形成回路。对照组仅行麻醉，气管插管，动静脉置管，不诱导室颤。缺血组大鼠诱发室颤15 min，不行心肺复苏(CPR)。CPR组：室颤诱发心脏骤停10 min，行5 min心肺复苏。15 min后处死各组大鼠，断颈取头，分离出海马组织。按1∶10 体积加入线粒体分离介质，匀浆10 次至无脑组织块。800 g 低温离心4 min，取上清液；再以16 000 g 低温离心15 min，弃上清，沉淀即为提取的线粒体。

2.检测指标： 采用Clark 氧电极法测定线粒体呼吸功能。反应槽内加入2．5 mL反应介质，充分搅拌使基础氧浓度达到240 nmol/mL 稳定状态，加入约2mg线粒体悬液孵育1 min，加入20 μL约4 mmol 琥珀酸二钠，测得的氧消耗率为Ⅳ态呼吸(R4)。再加入20 μL 二磷酸腺苷， 测得氧消耗率为Ⅲ 态呼吸(R3)。线粒体呼吸控制率(RCR)=R3/R4。液氮冻存海马神经元线粒体通过效液相色谱检测磷酸肌酸(PCr)、三磷酸腺苷(ATP)和乳酸(Lac)含量。经固定，脱水，环氧树脂包埋，超薄切片后等处理后置于电镜下观察线粒体超微结构并记录图像。

三、统计学分析

结 果

一、大鼠生理参数的比较

对照组、缺血组和CPR组的大鼠的基础体质量、复苏前心率、平均动脉压MAP比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 对照组、缺血组和CPR组大鼠生理参数比较

二、线粒体呼吸功能比较

Clark 氧电极测定呼吸功能结果显示，缺血组和CPR 组大鼠脑组织线粒体呼吸功能均较对照组明显下降，主要表现为R3 和RCR 值显著降低(P<0.05)；但CPR组的R3 和RCR 高于缺血组(P<0.05)。见表2。

表2 对照组、缺血组和CPR组大鼠海马组织线粒体呼吸功能比较

注:R3、R4单位：nmol/L·min-1·mg-1。与对照组比较：bP<0.05，aP<0.01；与缺血组比较:cP<0.05

三、能量代谢(PCr、ATP、乳酸含量)比较

本研究结果显示，与对照组相比，缺血组和CPR组的海马和皮层组织PCr和ATP含量均有不同程度下降(P<0.01)，其中缺血组PCr和 ATP含量的下降幅度更为明显；缺血组和CPR组乳酸浓度与对照组相比有所升高(P<0.01)，其中缺血组升高幅度更为明显(P<0.01)。见表3。

表3 对照组、缺血组和CPRZ组脑组织能量物质(PCr、ATP)和乳酸(Lac)含量

注:与对照组比较:aP<0.01；与缺血组比较:bP<0.01

四、脑组织线粒体超微结构

3组大鼠脑组织线粒体内细胞胞体及细胞器无明显肿胀，胞核圆形透明，核仁都比较明显；线粒体结构比较完整，排列整齐，嵴丰富；核糖体丰富，基质密度均匀，内质网结构清晰明朗，形态学上差异无统计学意义(图1)。

讨 论

脑是人体各器官中对氧的需求最大的器官，脑的重量只占体重的2%，而耗氧量占人体总耗氧量的20%～30%，心脏输出血量的15%都供给了脑。心跳骤停后CPR过程本质上是全身缺血再灌注的过程，随之引起广泛的器官损伤，称之为“心跳骤停后综合征”，主要包括脑损伤，心肌功能障碍，全身性缺血再灌注反应及持续诱因性病变[6]。在发生心跳骤停时，心脏血供完全中断，此时“高质量持续CPR”[7]在提高重要脏器再灌注血流水平就显得非常重要。

图1 大鼠脑组织超微结构 注：A.对照组;B.缺血组;C.CPR组

线粒体是糖类、脂肪和氨基酸等物质最终氧化释能的场所[8]，这些物质进入线粒体基质中，参加三羧酸循环过程中释放的能量，生成高能化合物ATP。线粒体中还存在着电子传递系统，调控着细胞各种能量物质代谢过程。线粒体呼吸控制率(RCR)是指R3呼吸与R4呼吸之比，是评价线粒体结构完整性及氧化磷酸化偶联程度的敏感指标，反映了线粒体氧化磷酸化效率[9]。

本研究的结果显示,CPR组在室颤10 min后进行5 min有效CPR，其脑组织线粒体态Ⅲ呼吸速率和呼吸控制率比单纯15 min缺血组的损伤明显较轻(P<0.05)。CPR组中PCr和ATP含量较对照组有所下降，与缺血组相比却保持在较高水平，乳酸含量也比缺血组降低。通过电镜分析，心跳骤停15 min后，脑神经元细胞体及细胞器无明显肿胀，胞核圆形透明，核仁明显，线粒体结构完整，排列整齐，嵴丰富，基质电子密度均匀，核糖体丰富，内质网结构清晰。这结果提示我们，心跳骤停早期，线粒体损伤以功能性为主，线粒体形态结构改变并不明显；也提示我们，在心跳骤停后早期尽快实行高质量的CPR，并早期开始高级生命支持，尤其是以脑功能恢复为目的的复苏措施有重要意义。

传统观念认为，心跳骤停5 min后脑损伤将是不可逆性的。而本实验观察到心跳骤停后15 min脑线粒体超微结构改变不明显，只表现为能量代谢障碍，经过有效的CPR可以改善线粒体的功能障碍，提示通过调节线粒体功能的措施应该是潜在有希望的脑复苏治疗新靶点。目前，关于心跳骤停后全脑缺血损伤机制仍缺乏全面深入的了解，而目前证实有效的脑复苏措施低温治疗在临床中并没有广泛合理的推广应用，所以我们应该规范治疗流程同时进一步寻求有效的脑复苏措施。

1 Eckstein M，Stratton SJ，Chan LS.Cardiac arrest resuscitation evaluation in Los Angeles:CARE-LA[J] .Ann Emerg Med,2005,45(5):504-509 .

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4 朱军，方向韶，符岳，等． 窒息法与室颤法心肺复苏动物模型的比较研究[J]中华急诊医学杂志，2011，20(1)：14．

5 黄子通，方向韶． 心肺脑复苏动物模型的标准化问题[J]．中华急诊医学杂志,2009，18(1)：11．

6 Neumar RW，Nolan JP，Adrie C，et al.Post-cardiac arrest syndrome: epidemiology, pathophysiology, treatment, and prognostication. A consensus statement from the International Liaison Committee on Resuscitation (American Heart Association, Australian and New Zealand Council on Resuscitation, European Resuscitation Council, Heart and Stroke Foundation of Canada, InterAmerican Heart Foundation, Resuscitation Council of Asia, and the Resuscitation Council of Southern Africa); the American Heart Association Emergency Cardiovascular Care Committee; the Council on Cardiovascular Surgery and Anesthesia; the Council on Cardiopulmonary, Perioperative, and Critical Care; the Council on Clinical Cardiology; and the Stroke Council[J]. Circulation, 2008, 118(23): 2452-2483.

7 Field JM，Hazinski MF,Sayre MR,et al.2010 American Heart Association Guidelines for Cardiopulmonary Resuscitation and Emergency Cardiovascular Care [J]. Circulation,2010，122 (18):640-656.

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