海南产红树植物老鼠中2-苯并唑啉酮分离鉴定及含量测定

张宏武 丁 刚 李榕涛 魏建和 邹忠梅

1.中国医学科学院北京协和医院药用植物研究所，北京100193；2.中国医学科学院北京协和医院药用植物研究所海南分所，海南万宁571533

张宏武1丁 刚1李榕涛2魏建和1邹忠梅1

1.中国医学科学院北京协和医院药用植物研究所，北京100193；2.中国医学科学院北京协和医院药用植物研究所海南分所，海南万宁571533

目的分离制备海南产红树植物老鼠簕中指标性成分并建立其含量测定方法。方法选择老鼠簕高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）色谱中的主要成分作为其指标性成分进行分离鉴定，并应用HPLC建立其含量测定方法，色谱条件为：Shiseido（Pak-C18）色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相：乙腈-水（35∶65）。流速1.0 mL/min；检测波长：270 nm，柱温：30℃。结果从老鼠簕中分离鉴定了1个生物碱成分2-苯并唑啉酮，并建立了HPLC含量测定方法，在0.004 32～1.08 mg/mL范围内呈良好的线性关系（r=0.9999，n=5）。平均回收率（n=9）为97.54%。结论本方法准确、简便，重复性好，可用于海南产老鼠簕药材中2-苯并唑啉酮的含量测定。

老鼠簕；生物碱；高效液相色谱法

红树植物（Mangrove plants）是热带、亚热带海区潮间带特有的木本植物，我国利用红树植物作为药用已有较长的历史，尤其是民间用药。老鼠簕（Acanthus ilicifolius L.）为爵床科老鼠簕属植物，又名老鼠怕、软骨牡丹、蚧瓜等，其性寒，味淡，全株或根入药，为红树林重要的药用植物之一，与其他红树林植物共生于海滩及浅海中。全世界共有50种，其中属于红树林的老鼠簕、小花老鼠簕（A.ebracteatus Vahl）和厦门老鼠簕（A.xianmensis Zhang）主要分布在我国广西、广东、海南、台湾、福建和浙江南部沿海海岸［1］。民间广泛用于治疗急慢性肝炎、哮喘、风湿病、麻痹症、蛇伤等，有镇痛和抗感染作用。在海南民间常用老鼠簕消肿、解毒、治疗淋巴结肿大、急性肝脾疼痛、黄疸、胃痛和哮喘，将其根捣碎水煮，加上蜂蜜口服，是治疗乙型肝炎的特效药［2］。现代药理研究发现，其具有抗肝纤维化［3］和抗氧化［4-5］、抗肿瘤［6］、抗菌［7］、抗感染镇痛［8］、预防骨质疏松［9］等作用。化学成分研究表明老鼠簕主要含有生物碱、黄酮类、皂苷、甾醇类化学成分［10-14］，其中生物碱类成分是其抗感染、止痛活性的主要物质基础。有研究表明：老鼠簕中的2-苯并唑啉酮具有杀利什曼原虫的作用［15］。目前尚未见对海南产老鼠簕植物质量控制的报道，为了开发利用海南的红树植物资源，笔者首次对海南产红树植物老鼠簕药材的质量做了进一步的评价，对老鼠簕中的指标性成分——2-苯并唑啉酮，进行了分离制备和结构测定，并首次对其海南产8批老鼠簕药材中2-苯并唑啉酮含量进行了测定。该方法可靠、灵敏、重复性好，可以很好地控制药材的质量，为海南产老鼠簕药材的质量标准的制订提供了参考依据。

1 仪器与试药

仪器Fisher-Johns熔点仪（温度未校正）；Bruker-AM600核磁共振波谱仪（TMS做内标）；996-2487高效液相色谱仪（美国Waters公司）：600泵；PDA紫外可见检测器；empower工作站，电子天平（MSA125P-100-DU，赛多利斯，德国）；超声波清洗器（KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司）；恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。柱色谱Sephadex LH-20为Pharmacia公司产品，薄层色谱及柱色谱用硅胶均为青岛海洋化工厂产品。

试剂：色谱乙腈（Burdick&Jackon，美国）；娃哈哈纯净水；其余试剂均为北京化学试剂公司产分析纯试剂。

样品：8批海南产老鼠簕样品分别于2008、2009年采自海南文昌、琼山地区，由中国医学科学院海南分所助理研究员李榕涛鉴定为爵床科老鼠簕属植物A-canthus ilicifoliusL.的根。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

取老鼠簕药材1 kg，粉碎机粉碎，过40目筛，用95%乙醇回流提取2次，每次2 h，提取液减压回收溶剂至无醇味，得浸膏115 g，将115 g浸膏加适量水混悬后，用8倍量乙酸乙酯萃取3次。合并萃取液，并减压浓缩，得到乙酸乙酯部分5 g。将乙酸乙酯部分反复经硅胶（100～200目）柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇（100∶0～0∶100）系统梯度洗脱，并经Sephadex LH-20凝胶柱分离，用二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脱，得到化合物32.8 mg，经NMR鉴定为2-苯并唑啉酮。

2.2 2-苯并口恶唑啉酮对照品核磁数据

1H-NMR（600 MHz，CDCl3），δ7.21（1H，dd，H-7），7.16（1H，dd，H-4），7.12（2H，td，H-5，6）。13C-NMR（150 MHz，CDCl3），156.2（C-2），144.1（C-7a），129.5（C-3a），124.4（C-5），123.0（C-6），110.4（C-4），108.5（C-7）。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Shiseido（Pak-C18）色谱柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm）（日本）；流动相：乙腈-水（35∶65）。流速1.0mL/min；检测波长：270 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。按2-苯并唑啉酮峰计算，理论塔板数不低于4500。此色谱条件下，待测组分与其他组分均达到基线分离，符合定量要求。色谱分离见图1。

图1 老鼠簕样品和2-苯并口恶唑啉酮对照品的高效液相色谱图

2.3.2 溶液的制备

2.3.2.1 供试品溶液的制备取老鼠簕药材2.0 g（过60目筛）置于50 mL具塞锥形瓶中，加入30 mL甲醇，摇匀，充分溶解后，称重，超声提取20 min（功率：200 W；频率：40 kHz），冷却，加适量甲醇复重，再次超声提取20 min，冷却，加适量甲醇复重，合并滤液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，定量转移至5 mL量瓶中，冷却，加甲醇至刻度，摇匀。0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，备用。

2.3.3 标准曲线性的测定

2.3.4 检测限及定量限

精密量取“2.3.3”项下对照品溶液定量稀释，以信噪比S/N为3∶1，测得2-苯并唑啉酮的最低检测限为0.43 ng/mL；以信噪比S/N为10∶1，测定2-苯并唑啉酮最低定量限为1.73 ng/mL（S/N≥10）。

2.3.5 重复性试验

精密称取同一批老鼠簕药材粉末5份，按“2.3.2.1”项下供试品溶液制备方法制备5份供试品液，按照“2.3.1”项下色谱条件分别进样测定，记录色谱图，结果各共有峰相对保留时间的RSD小于1%，相对峰面积的RSD为0.95%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 精密度试验

取同一对照品溶液，按照“2.3.1”项下色谱条件下重复进样测定5次，记录色谱图，结果各共有峰相对保留时间的RSD小于1%，相对峰面积的其日间精密度的RSD为0.52%，日间精密度的RSD为1.70%。表明该方法精密度良好。

2.3.7 稳定性试验

取同一批次供试品溶液，分别于0、4、8、24、48 h分别按照“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果各共有峰相对保留时间的RSD小于1%，相对峰面积的RSD为1.2%。表明供试品在48 h内基本性良好。

2.3.8 回收率试验

精密称取同一已知含量的老鼠簕药材粉末约1.0 g，共9份，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，每3份一组，按老鼠簕药材中对照品含量的120%、100%、80%，即高、中、低浓度分别加入适量2-苯并唑啉酮对照品溶液（1.13 mg/mL），然后按“2.3.2.1”项下供试品溶液制备方法制备，测定结果，计算得到高、中、低浓度2-苯并唑啉酮的加样回收率分别为97.55%、97.27%、97.80%，平均加样回收率为97.54%，RSD为 0.97%（n=3），结果见表1。

表12 -苯并口恶唑啉酮加样回收率（n=3）

2.3.9 样品测定

取8批老鼠簕药材粉末，按“2.3.2.1”项下供试品溶液制备方法制备样品，按照“2.3.1”项下色谱条件进行测定老鼠簕药材中2-苯并唑啉酮的含量。结果见表2。

表2 老鼠簕药材中2-苯并口恶唑啉酮含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 对照品的选择

3.2 提取方法的选择

本实验曾分别用二氯甲烷、95%乙醇和甲醇作为提取溶剂，超声提取老鼠簕中2-苯并唑啉酮：提取2次，每次20 min，合并滤液，纯甲醇定容于5 mL量瓶中，高效液相色谱（HPLC）测定结果发现甲醇提取物中2-苯并唑啉酮最高。在确定提取溶剂后，又对甲醇超声提取和回流提取方式及提取次数进行了考察，结果表明：甲醇超声提取和回流提取对老鼠簕中2-苯并唑啉酮的含量影响不大，考虑到超声提取方法简便，易行，故选择超声提取方法，作为提取方法。对提取时间的考察：分别提取10、20、45、60 min，10 min不能完全提取，20 min和45 min结果基本相同，而60 min的结果比45 min略低，故选择提取20 min。所以最后确定提取方法为：甲醇超声提取2次，每次20 min。

3.3 流动相的筛选

本试验对甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水这三种流动相系统进行了筛选比较，结果发现甲醇-水系统和甲醇-0.1%甲酸水系统存在色谱峰拖尾的现象，而换用乙腈-水系统即可得到满意的色谱峰形，同时与其他杂质峰的分离度也很高。故选择乙腈-水系统作为流动相，并调节流动相，最终选择乙腈-水（35∶65）作为洗脱溶剂，老鼠簕药材中2-苯并恶唑啉酮与其他组分得到较好的分离，且峰形对称，出峰时间适宜，适合作为老鼠簕药材中2-苯并恶唑啉酮含量测定用流动相。

3.4 耐用性的考察

本实验换用Agilent（SB-C18）色谱柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm），用适当乙腈和水等度洗脱，2-苯并恶唑啉酮也达到基线分离，结果表明该方法耐用性较好。

3.5 柱温和检测波长的选择

本实验采用30℃柱温，可以减少流动相黏度、降低柱压并改善分离效果，同时降低环境对分离的影响程度，故将柱温定为30℃。用二极管阵列检测器在波长190～400 nm范围内进行全波长扫描，通过观察2-苯并恶唑啉酮的紫外图谱，发现2-苯并恶唑啉酮在270 nm左右处有最大吸收，并且在270 nm处测定基线波动小，峰形理想，样品中其他组分干扰小，所以选择270 nm作为HPLC的检测波长。

本方法直接进样，不需要进行前处理，杂质峰与样品峰能达到基线分离，且在该色谱条件下2-苯并恶唑啉酮对照品峰形均匀对称，证明本方法简便、准确、快速，重复性好，且该方法的重现性、稳定性、精密度、回收率试验均均能满足定量的要求，且专属性好，故可以用于海南产红树植物老鼠簕中2-苯并恶唑啉酮的含量测定。

3.6 样品测定结果

从海南不同产地的8批老鼠簕药材中2-苯并恶唑啉酮含量测定的结果来看，8批老鼠簕药材中2-苯并恶唑啉酮含量差异比较大，因此有必要对老鼠簕药材的采集、种植做进一步的系统研究及规范，从而保证老鼠簕药材质量的稳定性。

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Isolation,identification and quantitative analysis of 2-Benzoxzololinone in Mangrove Acanthus ilicifolius L.from Hainan Province

ZHANG Hongwu1DING Gang1LI Rongtao2WEI Jianhe1ZOU Zhongmei1
1.Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Science&Peking Union Medical College, Beijing100193,China;2.Hainan Branch Institute of Medicinal Plant,Chinese Academy of Medical Science&Peking Union Medical College,Hainan Province,Wanning571533,China

ObjectiveTo reporte the isolation of 2-Benzoxzololinone alkaloid from the roots of Acanthus ilicifolius L. and establish a HPLC method to determine the content of the 2-Benzoxzololinone alkaloid in the root of Mangrove A-canthus ilicifolius L.from Hainan Province.MethodsA Shiseido(Pak-C18)(5 μm,4.6 mm×150 mm)column was used with a mobile phase of acetonitrile-water(35∶65).The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was setted at 30℃.The detection wavelength was 270 nm.ResultsThe linear range of 2-Benzoxzolol was 0.004 32～1.08 mg/mL (r=0.9999,n=5)and the average recovery(n=9)was 97.54%.ConclusionThe method is accurate,simple,reproducible,and can be used to determine the content of 2-Benzoxzololinone alkaloid in Acanthus ilicifolius L.from Hainan Province.

Acanthus ilicifolius L.;Alkaloid;HPLC

R284

A

1673-7210（2015)02（b)-0106-04

2014-10-31本文编辑：卫轲）

张宏武（1977.5-），女，硕士，主要从事天然产物化学研究。

邹忠梅（1964.4-），女，博士，博士生导师，主要从事天然产物化学研究。