斑蝥素酸镁对人肝癌细胞SMMC-7721裸鼠皮下移植瘤凋亡的影响

晏 容，刘 云，朱欣婷，易小飞，刘 流，张云辉，李晓飞*

1 遵义医学院基础医学院;2 遵义医学院医学与生物学研究中心，遵义 563003;3 贵州柏强制药有限公司，贵阳 550001

斑蝥素是一种来源于抗癌昆虫——斑蝥的抗肿瘤活性物质，对原发性肝癌、腹水型肝癌等具有良好治疗效果［1］，但由于其水溶性差，造成在使用上的诸多不便。目前，国内已有研究者制备出水溶性较好的斑蝥酸钠，并将其开发为注射液广泛应用于临床治疗(如:贵州柏强制药有限公司开发的《斑蝥酸钠维生素B6 注射液》)。本课题组在此基础上，以斑蝥素为原料研制出一种水溶性和体外抗癌活性都较好的斑蝥素盐类衍生物——斑蝥素酸镁［2，3］。为了进一步明确该化合物的体内抗癌活性，课题组构建了人肝癌细胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤模型，并对斑蝥素酸镁的体内抑癌机制进行了初步研究，以期为下一步开发打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 药物

斑蝥素酸镁由自制斑蝥素合成而来，已授权国家发明专利［4］。

1.1.2 肝癌细胞株

人肝癌细胞SMMC-7721 购自中国科学院细胞库。

1.1.3 实验动物

BALB/C 裸鼠，4 周龄，体重15～17 g，雄性，购于重庆腾鑫生物技术有限公司，许可证号:SCXK(京)2009-0004;在遵义医学院实验动物中心SPF 级条件下饲养，动物实验室合格证号:SYXK(黔)2011-003。

1.1.4 试剂

RPMI-1640 培养基购自美国GIBCO 公司;南美胎牛血清、胰蛋白酶购自美国HYCLONE 公司;鼠抗人AFP 单克隆抗体、SP 免疫组化试剂盒、PV6001 二步法免疫组化检测试剂盒及鼠抗人bcl-2、bax 单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.1.5 仪器

3131 型CO2培养箱，美国Thermo 公司;超净工作台，苏州净化设备有限公司;倒置显微镜，日本Nikon 公司;NikonYS100 光学显微镜，日本Nikon 公司;H-7550 型透射电镜，日本Hitachi 公司;JEM-1400 型透射电镜，日本电子公司;细胞图像分析系统，德国Leica 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肝癌细胞的培养

人肝癌细胞SMMC-7721 采用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱培养。

1.2.2 人肝癌细胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤模型的建立

取对数生长期的人肝癌细胞SMMC-7721，PBS洗两次，用0.25%胰酶消化，1000 rpm 离心5 min，收集细胞，镜下计数。生理盐水调整细胞密度为1×107/mL，每只取0.2 mL 接种于裸鼠腋窝皮下，接种后每日观察裸鼠成瘤情况。随机挑取已成瘤的裸鼠三只，颈椎脱位法处死裸鼠，取移植瘤标本。置于10%福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片，HE 染色后用光镜观察移植瘤组织病理学变化。同时按照SP 试剂盒说明书进行免疫组化染色。阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。AFP 染色的阳性判断:肿瘤细胞胞浆出现黄色或棕黄色物质。最后结合移植瘤组织病理学变化和AFP 染色结果确定人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型是否成功建立。

1.2.3 实验动物分组及处理

实验随机分为两组，分别为生理盐水组(n=5)、斑蝥素酸镁组(n=5)。待移植瘤体积大小约150～250 mm3开始用药，以每只裸鼠6.26×10-5mmol 剂量的斑蝥素酸镁进行瘤周注射，对照组给予相同容积的无菌生理盐水瘤周注射，注射隔日一次，共计11 次;22 d 后，观察裸鼠皮下移植瘤生长情况，并取出实体瘤作后续研究。

1.2.4 人肝癌裸鼠皮下移植瘤组织形态特征的观察

取斑蝥素酸镁组、生理盐水组移植瘤标本，置于10%福尔马林中固定，常规石蜡包埋、切片，HE 染色，光镜下观察移植瘤的组织形态特征。

1.2.5 透射电镜观察人肝癌裸鼠皮下移植瘤组织超微结构

移植瘤标本置于3.5%戊二醛进行前固定;PBS冲洗后用1%锇酸后固定2 h;常规梯度丙酮脱水;梯度Epon812 包埋剂浸透，纯包埋剂包埋并聚合;超薄切片;染色;透射电子显微镜下观察。

1.2.6 免疫组化法检测人肝癌裸鼠皮下移植瘤组织中bcl-2、bax 的表达

将瘤体于10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片。按照PV6001 二步法免疫组化检测试剂盒说明进行操作。阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。将切片置于光镜下观察，细胞质和细胞膜染成棕黄色或棕褐色的即为bcl-2、bax 阳性细胞。采用Image-Pro Plus 图像分析软件对bcl-2、bax 的表达进行定量分析(每张切片随机选取5 个高倍镜视野，测量每个视野下阳性细胞的平均光密度值)。

1.2.7 统计学分析

数据用SPSS 13.0 软件包进行单因素方差分析，P＜0.05 表示有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 人肝癌细胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤模型的建立

裸鼠皮下移植瘤模型是常用的一种肿瘤实验研究模型，具有方法简便、成瘤率高、易于观察、测量等优点［5］，因而在肿瘤研究中得了广泛应用。本试验将人肝癌细胞SMMC-7721 接种于裸鼠皮下以观察肿瘤生长情况。结果显示:平均8～10 d 裸鼠腋窝皮下接种处出现瘤块，成瘤率100%，随着饲养时间的延长，瘤块逐渐增大(图1)，无自发消退现象。HE 染色，在光学显微镜下可见，肿瘤细胞呈大小不等实性、巢团状分布，未见明确坏死灶，间质纤维组织增生、玻变(图2)。AFP 染色呈阳性即肿瘤细胞胞浆可见棕黄色物质(图3)。HE 染色、AFP 染色证实为肝细胞性肝癌组织，表明裸鼠皮下移植瘤模型建立成功。

图1 裸鼠成瘤Fig.1 Tumor formation in nude mice

图2 移植瘤组织HE 染色(×100)Fig.2 HE staining of transplantation tumor tissue(×100)

图3 移植瘤组织AFP 染色(×400)Fig.3 AFP staining of transplantation tumor tissue(×400)

2.2 斑蝥素酸镁对人肝癌裸鼠皮下移植瘤增殖和组织形态的影响

图4 斑蝥素酸镁对人肝癌细胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤增殖的影响Fig.4 The effects of magnesium cantharidate on the proliferation of subcutaneous transplantation tumor from human hepatoma cells SMMC-7721 in nude mice

图5 斑蝥素酸镁对人肝癌细胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤组织形态的影响(HE 染色×400)Fig.5 The effects of magnesium cantharidate on the histomorphology of subcutaneous transplantation tumor from human hepatoma cells SMMC-7721 in nude mice(HE staining×400)

斑蝥素酸镁处理22 d 后，与生理盐水对照组比较，斑蝥素酸镁处理组皮下移植瘤的体积明显小于对照组(图4)，可见斑蝥素酸镁对皮下移植瘤增殖有较强的抑制作用。在此基础上，可以利用组织形态学方法进一步检测其细胞凋亡情况。从图5A 中可以看出，生理盐水组:裸鼠移植瘤细胞排列呈条索状、厚度约3～8 层，条索间可见裂隙状血窦，肿瘤细胞呈圆形、多边形，胞浆丰富、红染，细胞核大、深染，可见病理性核分裂。斑蝥素酸镁组:癌细胞胞浆固缩、嗜酸性变。细胞核固缩、碎裂(图5B)。

2.3 斑蝥素酸镁对人肝癌裸鼠皮下移植瘤组织超微结构的影响

在HE 染色法的基础上进一步结合透射电镜进行观察，透射电镜是最经典可靠的判定细胞凋亡的方法，被认为是鉴定细胞凋亡的金标准。镜下见生理盐水组移植瘤细胞表面有细小突起，核质比正常，核膜核仁清晰，粗面内质网、线粒体清晰可见(图6A)。斑蝥素酸镁组移植瘤细胞核膜基本消失，染色质聚集成团，细胞质均质，细胞器基本消失(图6B)。形态学检测表明斑蝥素酸镁在裸鼠体内可诱导肝癌细胞凋亡。

图6 斑蝥素酸镁对人肝癌细胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤组织超微结构的影响Fig.6 The effects of magnesium cantharidate on the ultrastructure of subcutaneous transplantation tumor from human hepatoma cells SMMC-7721 in nude mice

2.4 斑蝥素酸镁对人肝癌裸鼠皮下移植瘤组织中bcl-2、bax 表达的影响

2.4.1 染色观察

光镜下观察细胞质和细胞膜染成棕黄色或棕褐色的即为bcl-2、bax 阳性细胞。从图7A、7B 可见，斑蝥素酸镁组瘤组织中bcl-2 阳性细胞数量与着色强度低于生理盐水组。从图7C、图7D 可见，斑蝥素酸镁组瘤组织中bax 阳性细胞数量与着色强度高于生理盐水组。

2.4.2 图像分析平均光密度值测定

斑蝥素酸镁组瘤组织中bcl-2 阳性细胞的平均光密度值(0.172±0.024)，显著低于生理盐水组(0.318±0.063)(P＜0.05)。斑蝥素酸镁组瘤组织中bax 阳性细胞的平均光密度值(0.483±0.124)，显著高于生理盐水组(0.219±0.071)(P＜0.05)。

图7 斑蝥素酸镁作用后人肝癌细胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤组织中bcl-2、bax 的表达(×400)Fig.7 The expressions level of bcl-2，bax of subcutaneous transplantation tumor from human hepatoma cells SMMC-7721 in nude mice treated by magnesium cantharidate(×400)

研究表明，细胞凋亡受细胞内多种基因调控［6］。其中，bcl-2 和bax 基因均属于bcl-2 家族中的重要成员。bcl-2 基因是目前公认的重要的细胞凋亡调控基因，Schindler 等实验发现bcl-2 基因可以通过抑制细胞凋亡，延长细胞寿命而促进肿瘤的发生［7］。而bax 是目前研究最深入的促凋亡基因之一，其编码的Bax 蛋白能够促进细胞凋亡［6］。本实验采用免疫组化法检测人肝癌裸鼠皮下移植瘤组织中bcl-2、bax 的表达水平，结果显示斑蝥素酸镁组瘤组织中bcl-2 的表达低于生理盐水组，而bax 的表达高于生理盐水组。

3 结论

本实验通过对瘤体积大小、HE 染色组织形态学、透射电镜、bax 和bcl-2 凋亡相关蛋白一系列指标的比较研究，初步探讨了斑蝥素酸镁的体内抗癌机制。研究结果显示斑蝥素酸镁能明显抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的增殖;并能诱导移植瘤细胞发生凋亡，其机制可能与上调bax 和下调bcl-2 表达有关。

1 Huang TK(黄泰康).Commonly used Traditional Chinese Medicine Composition and Pharmacological Manual，the Second Volume.Beijing:Chinese Medical Science and Technology Press，1994.1651.

2 Liu Y(刘云)，Hu SS(胡姗姗)，Lou FM(娄方明)，et al.Inhibitory effect of magnesium cantharidate on proliferation of lung adenocarcinoma.Lishizhen Med Mater Med Res(时珍国医国药)，2013，24:26-28.

3 Li XF(李晓飞)，Lou FM(娄方明)，Yan R(晏容)，et al.Inhibitory effect on human hepatoma QGY-7703 cell exposed to three kinds of cantharidate.Chin J Gerontol(中国老年学杂志)，2013，33:2049-2050.

4 Li XF(李晓飞).Magnesium cantharidate and its preparation method:Chinese，ZL201110149288.5，2013-04-17.

5 Wang W，Kim SH，El-Deiry WS.Small molecule modulators of p53 family signaling and antitumor effects in p53 deficient human colon tumor xenografts.Proc Nat Acad Sci USA，2006(29):11003-11008.

6 Guo QL(郭青龙).Oncological Pharmacology，Version 1.Beijing:Chemical Industry Press，2008.67-68.

7 Schindler CK，Shinoda S，Simon RP，et al.Subceller distribution of Bcl-2 family protein and 14-3-3 within the hippocam-pus during seizure-induced neuronal death in the rat.Neurosci Lett，2004，356:163-166.