华泽兰根的化学成分及其体外抑菌活性研究

刘梦元，虞丽娟，李燕慈，田 珂，李路军，，吴正治

1 生物资源绿色转化湖北省协同创新中心，武汉 430062;2 深圳市老年医学研究所，深圳 518020

华泽兰(Eupatorium chinense L.)为菊科(Com-positae)泽兰属(Eupatorium)植物，多年生草本或半灌木，常生长于山谷、林缘、草地或灌木丛中，主要分布于中国东南部至西南部各省。其干燥根，又名广东土牛膝、多须公、斑骨相思等。具有清热解毒、凉血利咽、抗炎镇痛的功效，主治白喉、蛾喉、咽喉肿痛等症，有“喉科圣药”之称，对喉部疾病疗效显著，民间使用极为广泛［1］。目前文献报道从泽兰属植物中分离到的主要化学成分为黄酮类和倍半萜类化合物［2，3］。为分离其中抗菌活性成分，合理开发利用这一药用植物资源，本实验对华泽兰根的化学成分进行了系统的研究。从华泽兰根95%乙醇提取物中分离得到9 个化合物，分别鉴定为达玛二烯醇乙酸酯(1)、(2R，3S)-5-乙酰基-6-羟基-2-异丙烯基-3-乙氧基苯并二氢呋喃(2)、豆甾醇(3)、邻苯二甲酸二丁酯(4)、12，13-dihydroxyeuparin(5)、5-乙酰-6-羟基-2-异丙烯基苯并呋喃(6)、2，5-二乙酰基-6-羟基苯并呋喃(7)、ruscodibenzofuran(8)、2-乙酰-5-(1-炔丙基)-噻吩-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(9)，化合物1、2、4 和8 为首次从该种植物中分离得到，其中2、4和8 为首次从该属植物中分离得到。在此基础上，采用牛津杯法评价部分苯并呋喃类化合物的抑菌活性，并用肉汤稀释法测定它们的MIC 值。以上研究丰富了该植物的化学成分研究内容，探索其抗菌活性的物质基础，有利于寻找具有潜在药物开发价值的抗菌活性先导化合物，为充分开发利用华泽兰奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

Varian INOVA 600 型核磁共振仪(内标为TMS，美国Varian 公司)，WNMR 400 型核磁共振仪(中科开物);X-6 显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司，温度未校正);EZ Purifier MPLC(苏州利穗科技有限公司);Knauer smartline 型半制备HPLC(德国，诺尔)，Agilent 1100 分析型HPLC(美国，安捷伦科技公司)，YMC-Pack ODS-A 系列色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，1 mL/min;250 mm×9.4 mm，5 μm，3 mL/min)，ZF-6 型三用紫外线分析仪(上海嘉鹏科技有限公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);iMark 酶标仪;96 孔平底微孔板(Costar3599，USA，Corning);游标卡尺(富远);牛津杯(Φ 6 mm)。

1.2 试剂

LB 培养基，哥伦比亚血琼脂平板(广东环凯微生物科技有限公司);KF 链球菌肉汤培养基:青岛海博生物技术有限公司;氨苄青霉素(AMP，BIOSHARP 公司生产，批号0339);Sephadex LH-20(GE Healthcare，Bio-sciences AB，Sweden);薄层色谱用硅胶GF254、柱色谱用硅胶(100～200 目，200～300 目)均为青岛海洋化工厂产品;色谱甲醇为美国Tedia公司产品;色谱乙腈为美国fisher 公司产品;其他试剂为分析纯。

1.3 材料与菌种

实验用药材采自湖南省泠水江市和青镇，经中国科学院华南植物园宁祖林博士鉴定为菊科泽兰属(Eupatorium)植物华泽兰(Eupatorium chinense L.)的干燥根，样品标本保存于湖北大学中药生物技术湖北省重点实验室。实验所选菌种:大肠埃希菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)5 种标准菌株由华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科馈赠。

1.4 提取与分离

华泽兰干燥根17.5 kg，适当粉碎后用90%乙醇回流提取3 次，每次提取2 h，合并提取液，减压回收溶剂至无醇味，用适量水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，回收溶剂得石油醚萃取物375 g，乙酸乙酯萃取物412 g，正丁醇萃取物1071 g。取石油醚萃取物经硅胶(100～200 目)柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯系统(100∶1～1∶100)梯度洗脱得A～G 7 个流份。C 流份再次通过硅胶(200～300目)柱色谱，石油醚-乙酸乙酯(65∶1)洗脱，所得流份重结晶得化合物1(8.84 mg);D 流份经过硅胶(200～300 目)柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯(50∶1～40∶1)洗脱得流份D1～D5，D3经过半制备HPLC(甲醇∶水=7∶3)得化合物2(27.6 mg);E 流份经过硅胶(200～300 目)柱色谱用石油醚-乙酸乙酯系统(15∶1～10∶1)洗脱得到化合物3(10.8 mg);G 流份经过硅胶(200～300 目)柱色谱用石油醚-乙酸乙酯系统(1∶1)洗脱得到G1和G2，G1通过制备薄层色谱得化合物4(70.74 mg);G2经过半制备HPLC(乙腈∶水=6∶4)得化合物5(4.88 mg)。取乙酸乙酯萃取物经硅胶(100～200 目)柱色谱，用二氯甲烷-甲醇(100∶1，50∶1，25∶1，10∶1，5∶1，2∶1，1∶1，1∶100)梯度洗脱，得到A～H 8 个流份，B 流份经过MPLC(甲醇∶水=6∶4)得化合物6(48.72 mg)和化合物8(78.10 mg);C 流份经过MPLC(二氯甲烷∶甲醇=75∶25)，再过Sephadex LH-20 凝胶得化合物7(29.89 mg)。E 流份经过MPLC(二氯甲烷∶甲醇=10∶1)得到E1～E66 个流份，E2流份经过半制备HPLC(乙腈∶水=1∶19～1∶0)得化合物9(3.21 mg)。

1.5 化合物抑菌活性测定

1.5.1 样品溶液的配置

将分离得到的单体化合物1～4、6～8 分别用DMSO 溶解配制成2 mg/mL 的样品溶液，备用。

1.5.2 菌悬液制备

取肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌分别接种于LB 营养琼脂培养基上，肺炎链球菌接种于哥伦比亚血琼脂培养基培养上，37 ℃复苏培养24 h 得到单菌落，用接种环挑1～2 个菌落分别接种于配好的LB 液体培养基，取肺炎链球菌单菌落接种到KF 链球菌肉汤培养基中，分别于37 ℃，280 rpm 的摇床中培养8～10 h，得实验用菌液(106～107CFU/mL)，备用。

1.5.3 抑菌活性筛选

抑菌活性采用牛津杯法进行。在无菌超净工作台中，将配制好的的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌分别均匀涂抹在LB固体培养基上，肺炎链球菌均匀涂抹在哥伦比亚血琼脂培养基培养上。取消毒灭菌后的牛津杯放置在培养基表面，分别加入样品溶液200 μL，勿使其外溢，选用DMSO 为空白对照，50 μg/mL 的AMP 作为阳性对照，置于37 ℃恒温培养箱中培养18 h，游标卡尺测量各自的抑菌圈直径。每个样品平行测定3次，取平均值作为最终结果。

1.5.4 最低抑菌浓度测定

肉汤稀释法［4］测定MIC 值，二倍稀释法配制系列浓度的样品溶液，终浓度分别为:250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.25、0.125 μg/mL。分别加入20 μL，106～107CFU/mL细菌悬浮液，不添加样品的为对照组。试管37 ℃温浴16～18 h，用酶标仪在600 nm 条件下测样品OD值，MIC 值为明显抑制细菌生长的最低化合物浓度。

2 结果与分析

2.1 结构鉴定

化合物1 白色粉末，易溶于氯仿，mp.263～265 ℃。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:0.84，0.85，0.86，0.87，0.97，1.62，1.69(21H，s，7×CH3)，2.04(3H，s，CH3COO)，5.13(1H，tt，J=7.0，1.3 Hz，H-24)，4.74(1H，d，J=1.3 Hz，H-21a)，4.71(1H，d，J=1.3 Hz，H-21β)，4.48(1H，dd，J=11.2，4.8 Hz，H-3);13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:38.1(C-1)，23.9(C-2)，81.2(C-3)，37.4(C-4)，56.2(C-5)，18.4(C-6)，35.6(C-7)，40.7(C-8)，51.1(C-9)，39.0(C-10)，21.6(C-11)，25.2(C-12)，48.0(C-13)，49.6(C-14)，31.6(C-15)，29.2(C-16)，45.6(C-17)，16.4(C-18)，16.7(C-19)，153.0(C-20)，107.7(C-21)，34.5(C-22)，27.3(C-23)，124.8(C-24)，131.6(C-25)，25.8(C-26)，17.9(C-27)，28.2(C-28)，15.9(C-29)，16.1(C-30)，171.1(C-31，Ac)，21.4(C-32，Ac)。以上数据与文献［5］基本一致，化合物1 鉴定为达玛二烯醇乙酸酯。

化合物2 白色针晶(氯仿)，易溶于乙酸乙酯，难溶于甲醇，mp.62～65 ℃。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:1.24(3 H，t，J=7.0 Hz，H-16)，1.69(3 H，br.s，H-14)，2.56(3 H，s，H-11)，3.60(2 H，q，J=7.0 Hz，H-15)，4.75(1 H，d，J=2.0 Hz，H-3)，5.06(1 H，d，J=2.0 Hz，H-2)，4.91(1 H，br.s，H-13α)，5.03(1 H，br.s，H-13β)，6.41(s，1H，H-7)，7.71(1H，s，H-4)，12.98(1H，s，OH);13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:93.1(C-2)，82.2(C-3)，129.3(C-4)，118.7(C-5)，167.3(C-6)，98.9(C-7)，167.4(C-8)，114.7(C-9)，202.4(C-10)，26.4(C-11)，141.6(C-12)，113.4(C-13)，17.7(C-14)，63.9(C-15)，15.6(C-16)。以上数据与文献［6］基本一致，化合物2 鉴定为(2R，3S)-5-乙酰基-6-羟基-2-异丙烯基-3-乙氧基-苯并二氢呋喃。

化合物3 白色晶体(氯仿)，与硫酸-乙醇试剂反应显红色，mp.145～146 ℃。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:5.35(1H，br.d，J=5.0 Hz，H-6)，3.55(1H，m，H-3)，0.69(3H，s，CH3-18)，0.83(3H，s，CH3-19)，0.91(3H，d，J=6.0 Hz，H-21)，5.13(1H，dd，J=8.0，15.1 Hz，H-22)，5.01(1H，dd，J=8.0，15.1 Hz，H-23)，0.84(3H，d，J=6.3 Hz，CH3-26)，0.79(3H，d，J=5.5 Hz，CH3-27)，0.81(3H，t，J=7.4 Hz，CH3-29);13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:37.6(C-1)，32.0(C-2)，72.1(C-3)，40.6(C-4)，141.0(C-5)，121.9(C-6)，32.2(C-7)，32.2(C-8)，50.5(C-9)，36.8(C-10)，21.2(C-11)，40.0(C-12)，42.6(C-13)，56.3(C-14)，24.6(C-15)，29.1(C-16)，57.2(C-17)，12.3(C-18)，19.6(C-19)，42.5(C-20)，21.2(C-21)，138.5(C-22)，129.6(C-23)，51.5(C-24)，31.9(C-25)，19.2(C-26)，21.3(C-27)，25.6(C-28)，12.5(C-29)。以上数据与文献［7］基本一致，化合物3 鉴定为豆甾醇。

化合物4 黄色油状物质，易溶于氯仿，难溶于丙酮，甲醇。1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:7.70(2H，dd，J=3.42，5.88 Hz，H-2，5)，7.51(2H，dd，J=3.42，5.88 Hz，H-3，4)，4.30(4H，t，J=6.96 Hz，H-1＇，1＇＇)，1.75(4H，tt，J=6.96，7.68 Hz，H-2＇，2＇＇)，1.43(4H，tq，J=7.56，7.72 Hz，H-3＇，3＇＇)，0.95(6H，t，J=7.56 Hz，H-4＇，4＇＇);13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ:167.8(C-7，8)，131.0(C-1，6)，128.9(C-2，5)，132.4(C-3，4)，65.7(C-1＇，1＇＇)，30.7(C-2＇，2＇＇)，19.3(C-3＇，3＇＇)，13.8(C-4＇，4＇＇)。以上数据与文献［8］基本一致，化合物4 鉴定为邻苯二甲酸二丁酯。

化合物5 白色粉末，溶于氯仿，UV254nm下显紫色荧光，mp.169～171 ℃。1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:1.59(3H，s，H-14)，2.67(3H，s，H-11)，3.69(1H，d，J=11.16 Hz，H-13a)，4.00(1H，d，J=11.16 Hz，H-13β)，6.66(1H，s，H-3)，6.97(1H，s，H-7)，7.91(1H，s，H-4);13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ:161.2(C-2)，103.8(C-3)，123.8(C-4)，117.1(C-5)，159.7(C-6)，99.9(C-7)，161.4(C-8)，121.1(C-9)，204.2(C-10)，27.0(C-11)，72.4(C-12)，68.9(C-13)，23.5(C-14)。以上数据与文献［9］基本一致，化合物5 鉴定为12，13-dihydroxyeuparin。

化合物6 黄绿色晶体(氯仿)，易溶于氯仿，可溶于甲醇、丙酮，mp.118～120 ℃。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:2.08(3H，s，H-14)，2.66(3H，s，H-11)，5.17(1H，s，H-13α)，5.74(1H，s，H-13β)，6.52(1H，s，H-3)，6.95(1H，s，H-7)，7.88(1H，s，H-4)，12.48(1H，s，OH);13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:158.2(C-2)，102.6(C-3)，123.7(C-4)，122.1(C-5)，159.9(C-6)，99.7(C-7)，161.9(C-8)，117.2(C-9)，204.0(C-10)，26.9(C-11)，132.4(C-12)，113.9(C-13)，19.4(C-14)。以上数据与文献［10］基本一致，化合物6 鉴定为5-乙酰基-6-羟基-2-异丙烯基-苯并呋喃。

化合物7 黄色晶体，易溶于氯仿，可溶于甲醇、丙酮，mp.144～146 ℃。1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:7.46(1H，s，H-3)，8.17(1H，s，H-4)，7.08(1H，s，H-7)，2.60(3H，s，H-13)，2.73(3H，s，H-11)，12.56(1H，s，OH-6);13C NMR(CDCl3，150 M Hz)δ:153.9(C-2)，113.2(C-3)，127.1(C-4)，118.6(C-5)，160.2(C-6)，100.5(C-7)，163.5(C-8)，119.9(C-9)，204.1(C-10)，27.1(C-11)，188.1(C-12)，26.6(C-13)。以上数据与文献［9］基本一致，化合物7 鉴定为2，5-二乙酰基-6-羟基-苯并呋喃。

化合物8 白色晶体，易溶于氯仿，可溶于甲醇、丙酮，mp.143～145 ℃。1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:12.78(1H，s，OH-6)，8.30(1H，s，H-4)，7.10(1H，s，H-7)，7.13(1H，d，J=7.4 Hz，H-14)，7.03(1H，d，J=7.4 Hz，H-13)，2.76(3H，s，H-11)，2.53(3H，s，H-16)，2.74(3H，s，H-17);13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ:155.7(C-2)，121.7(C-3)，124.8(C-4)，116.4(C-5)，163.2(C-6)，100.2(C-7)，161.4(C-8)，119.3(C-9)，203.8(C-10)，26.9(C-11)，118.5(C-12)，128.1(C-13)，124.7(C-14)，130.0(C-15)，15.0(C-16)，19.7(C-17)。以上数据与文献［11］基本一致，化合物8 鉴定为ruscodibenzofuran。

化合物9 白色晶体，mp.118～119 ℃。1H NMR(CD3COCD3，400 MHz)δ:7.14(1H，s，H-4)，5.10(1H，d，J=7.56 Hz，H-1＇)，4.71，4.45，4.34，3.82(4H，br.s 4×OH)，3.91(1H，dd，J=11.4，2.0 Hz，H-6＇α)，3.72(1H，dd，J=11.4，5.6 Hz，H-6＇β)，3.59(1H，m，H-3＇)，3.54(2H，m，H-2＇，H-5＇)，3.48(1H，m，H-4＇)，2.53(3H，s，H-10)，2.09(3H，s，H-8);13C NMR(CD3COCD3，100 MHz)δ:125.3(C-2)，157.3(C-3)，124.0(C-4)，130.2(C-5)，73.7(C-6)，95.5(C-7)，4.4(C-8)，190.1(C-9)，29.8(C-10)，103.4(C-1＇)，74.7(C-2＇)，78.2(C-3＇)，71.2(C-4＇)，78.3(C-5＇)，62.5(C-6＇)。以上数据与文献［12］基本一致，化合物9 鉴定为2-乙酰-5-(1-炔丙基)-噻吩-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.2 抑菌活性筛选

华泽兰中分离得到的化合物1～4 和6～8 抑菌活性实验结果如表1 所示，结果表明，除化合物2 对肺炎链球菌无明显抑菌活性外，测试化合物对供试菌均具有不同程度的抑菌活性。相对于阳性对照组，它们对肺炎克雷伯菌均具有较强的抑菌活性，化合物7 明显抑制大肠埃希菌生长，化合物1、6～8 对铜绿假单胞菌具有明显的抑菌活性，所有测试化合物对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌显示较弱抑菌活性。

表1 华泽兰根部分化合物抑菌活性筛选(n=3)Table 1 Antibacterial activities of compounds from E.chinense root(n=3)

2.3 最低抑菌浓度测定

化合物1～4 和6～8 对5 种供试菌的MIC 值，见表2。由表中MIC 值可知，化合物2 对肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌的MIC 值分别为3.91、3.91 μg/mL。化合物1、6 和8 对肺炎克雷伯菌抑菌活性最强，MIC 值分别为0.98、0.98 μg/mL 和0.49 μg/mL。5 种测试菌种，化合物7 对大肠埃希菌显示最强抑菌活性(MIC≤3.91 μg/mL)。化合物1、2、6和7 对铜绿假单胞菌的MIC 值均为7.81 μg/mL，化合物3 对所有测试菌的MIC 均大于250 μg/mL，所有测试化合物对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的MIC 均大于250 μg/mL。

表2 华泽兰根部分化合物最低抑菌浓度Table 2 The minimal inhibitory concentrations of compounds from E.chinense root

3 结论

本实验利用硅胶、Sephadex LH-20、HPLC 等各种色谱分离技术，从华泽兰根的乙醇提取物中分离得到9 个化合物，其中，1、6 和8 对肺炎克雷伯菌有较强抑菌活性，MIC 值分别为0.98 μg/mL、0.98 μg/mL 和0.49 μg/mL，化合物7 对大肠埃希菌显示较强抑菌活性(MIC≤3.91 μg/mL)，化合物1、2、6和7 对铜绿假单胞菌有较强抑菌活性，MIC 值均为7.81 μg/mL，由此推测化合物1 及苯并呋喃类化合物2、6、7、8 为华泽兰根主要抑菌活性成分。

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