石榴皮醇提物对胃癌SCG-7901细胞增殖的影响

孙泽敏，徐先林，欧刚卫（遵义医学院生物化学教研室，贵州遵义563099）

石榴皮醇提物对胃癌SCG-7901细胞增殖的影响

孙泽敏，徐先林，欧刚卫（遵义医学院生物化学教研室，贵州遵义563099）

目的探讨石榴皮醇提物对胃癌SCG-7901细胞增殖的影响及其机制。方法体外培养人胃癌SCG-7901细胞。制备石榴皮醇提物，药物最终浓度为100、80、60、40、20、10 μg/mL，并设置不加药的阴性对照组（0 μg/mL），采用四唑盐法、集落形成试验观察比较石榴皮醇提物对SCG-7901细胞增殖和克隆形成能力的影响；采用倒置显微镜观察提取物作用细胞48 h后的形态变化；采用流式细胞仪检测提取物作用48 h后细胞周期的变化。结果石榴皮醇提物对SCG-7901细胞的增殖具有明显的抑制作用，呈剂量依赖性；且石榴皮醇提物显著抑制SCG-7901细胞集落形成率。不同浓度的药物作用后，SCG-7901细胞数目减少，部分细胞死亡，细胞核固缩；细胞周期发生改变，与阴性对照组比较，S期细胞比例减少，G0/G1期细胞增多，出现明显G0/G1期阻滞。结论石榴皮醇提物可以抑制胃癌SCG-7901细胞增殖，干扰细胞G1期向S期转化。

石榴皮/化学； 醇类/药理学； 胃肿瘤； 细胞增殖

石榴（Punica granatum L.）属于石榴科石榴属落叶灌木或小乔木，原产于伊朗及阿富汗等中亚地区。目前在我国陕西临潼、山东枣庄、河南开封、安徽怀远、四川会理、云南蒙自和新疆等地均有一定规模的石榴适生栽培区[1]。在我国传统医药中主要用于久泻、出血、蛔虫等病症[2]。石榴皮是石榴的干燥果皮，其成分复杂多样，含鞣质、黄酮类、石榴皮碱、异槲皮苷、树脂、甘露醇、没食子酸等，并含多种氨基酸和多种微量元素[3-4]。近年来，随着国内外学者对石榴药理研究的不断深入，发现石榴具有抗菌、抗病毒、抗氧化、调血脂、降血压及免疫调节等作用[5]。其中抗肿瘤作用尤其受到重视，国外Ordoudi等[6]曾报道液态石榴皮萃取物可以抑制人体Burkitt淋巴瘤细胞的Raji和P3-HR1细胞群生长，并促进其凋亡；石榴籽还可以预防肝癌和抑制肝癌的转移[7]。国内研究也报道了石榴皮正丁醇提取物可以抑制人乳腺癌MCF-7细胞的生长[8]；石榴皮鞣花酸可明显抑制4T1细胞增殖诱导其凋亡，诱导并提高荷瘤小鼠特异性抗肿瘤免疫反应[9]。但是目前国内关于石榴皮提取物抗胃部肿瘤作用的药理研究较少。本文采用醇提法提取石榴皮中有效成分，以人胃癌细胞株SCG-7901作为研究对象，应用四唑盐（MTT）试验、集落形成试验、光镜、流式细胞仪等方法研究其对人胃癌SCG-7901细胞增殖的影响，并初步探讨其机制，希望为石榴皮的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材与试剂 石榴皮（贵州省药材公司，产地：贵州）、RPMI-1640培养基（美国Hyclone公司）、胎牛血清（杭州四季青科技有限公司）、胰蛋白酶（美国Amresco公司）、MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所）、吉姆萨染料（北京诺博莱德科技有限公司）、细胞周期试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司），其余试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），CO2培养箱、多功能酶标仪、冷冻干燥机（美国Thermo公司），倒置显微镜（日本Olympus公司），流式细胞仪（美国BD公司）。

1.1.3 细胞 人胃癌细胞株SCG-7901，购自中国细胞库典藏细胞中心，并由本教研室冻存，在37℃、5%CO2培养箱传代培养。

1.2 方法

1.2.1 石榴皮醇提物的制备 将石榴皮粉碎，过60目筛，5倍体积乙醇50℃回流提取3次，每次2 h。合并提取液，50℃旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥成粉末。使用前用培养基溶解并稀释至所需药物浓度。

1.2.2 MTT试验 取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，完全培养基重悬、计数，调整细胞浓度为每毫升8×104个，接种至96孔板，每孔100μL。于37℃、5%CO2培养箱中培养12 h。加入不同浓度的提取物20 μL，使其终浓度分别为100、80、60、40、20、10μg/mL，同时设定阴性对照组0μg/mL（即只加细胞，不加药）。每组5个重复。培养箱中继续培养48 h后，取出培养板，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，在细胞培养箱内继续孵育4 h。然后每孔加入100 μL Formanzan溶解液，平板摇床振摇5 min，使结晶紫颗粒溶解。于酶标仪的570 nm处测定吸光度。按下列公式计算生长抑制率：抑制率（%）=（A阴性对照组-A试验组）/A阴性对照组×100%。

1.2.3 集落形成试验 取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，完全培养基重悬、计数，调整细胞浓度为每毫升200个，接种至6个空孔板，每孔1 mL。于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。加入不同浓度的提取物1 mL，使其终浓度为100、80、60、40、20、10 μg/mL，同时设定不加药的阴性对照组0 μg/mL。每组3个重复。每2天更换含药培养基1次，连续培养10 d。小心弃去培养基，甲醇固定5 min，加入新鲜配制的吉姆萨染料1 mL。室温染色20 min，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗去多余的染料，晾干后镜检（100×）。计算克隆形成率（%）=克隆数/接种细胞数×100%。

1.2.4 细胞形态观察 将细胞制成单细胞悬液，接种至25 mL培养瓶中，每瓶4 mL。培养12 h，加入不同浓度的提取物4mL。同时设定不加药的阴性对照组0 μg/mL。培养箱中培养48 h后，倒置显微镜下观察细胞的生长变化情况。

1.2.5 细胞周期试验 将细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为每毫升8 000个，接种至25 mL培养瓶中，每瓶4 mL。培养12 h。加入不同浓度的提取物4 mL，同时设定不加药的阴性对照组0 μg/mL。48 h后收集细胞，用预冷的70%乙醇固定。按照细胞周期试剂盒染色，并用流式细胞仪检测细胞周期的分布情况。

1.3 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。采用Sigmaplot 12.5软件作图。

2 结 果

2.1 石榴皮醇提物对SCG-7901细胞增殖的影响 提取物在10～100 μg/mL浓度内可以明显抑制肿瘤细胞的增殖，并呈剂量效应关系，抑制率分别为10.21%、18.67%、32.35%、41.28%、61.85%、75.27%。以提取物浓度为横坐标、抑制率为纵坐标作回归曲线，回归方程为：Y=0.714X+ 3.043，R2=0.99，半数抑制率（IC50）为66 μg/mL，见图1。

图1 石榴皮醇提物对SGC-7901细胞增殖的影响

图2 石榴皮醇提物对SGC-7901克隆形成率的影响

2.2 石榴皮醇提物对SCG-7901细胞克隆形成的影响 不加药物时（即阴性对照组0 μg/mL），克隆形成能力较强，为65%。提取物在10～100 μg/mL浓度内，随着药物浓度的增加，克隆数减少，克隆能力减弱，抑制细胞克隆的形成。药物浓度在100、80、60、40、20、10 μg/mL时的克隆形成率（52.34%、43.38%、39.57%、25.40%、19.02%、16.21%）与阴性对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2。

2.3 石榴皮醇提物对SCG-7901细胞形态的影响 阴性对照组细胞形态饱满，贴壁明显，折光性强，见图3A。细胞经1/2 IC50（33 μg/mL）和IC50（66 μg/mL）的提取物处理48 h以后，细胞数目锐减，细胞间连接减少，细胞质浓缩，细胞坏死，大部分细胞悬浮于培养基中，见图3B、3C。

图3 石榴皮醇提取物对SGC-7901细胞形态的影响（100×）

2.4 石榴皮醇提物对SCG-7901细胞周期的影响 细胞经1/2 IC50（33 μg/mL）和IC50（66 μg/mL）石榴皮醇提物处理48 h后与阴性对照组比较，G0/G1期细胞随着药物浓度的增大而增多，相应的S和G2/M期细胞减少，出现明显的G0/G1阻滞。各时期DNA含量与阴性对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图3。

表1 各组不同时期DNA含量比较（±s，%）

表1 各组不同时期DNA含量比较（±s，%）

注：与阴性对照组比较，aP＜0.05。

组别阴性对照组（0 μg/mL）1/2IC50组（33 μg/mL）IC50组（66 μg/mL）G0/G1 S G2/M 54.61±1.35 65.80±2.33a78.40±2.51a28.60±2.81 21.64±4.29a12.46±1.73a16.82±2.24 12.55±3.12a9.11±1.78a

图3 石榴皮醇提物对SGC-7901细胞周期的影响

3 讨 论

癌症是一种死亡率极高、严重威胁人类生命与健康的疾病，是全世界科学家长期以来最想攻克的难题之一[10]。WHO在2014年初发布的《世界癌症报告》中指出，2012年有1 400万人被诊断患癌，预测到2035年这个数据将增至2 400万，且40岁以后的发病率和病死率呈快速上升趋势，而胃癌的病死率居前3位[11]，因此，胃癌的研究已经成为目前的热点与难点。

本研究采用MTT方法检测石榴皮醇提物对人胃癌SGC-7901细胞的增殖有明显抑制作用，其IC50为66μg/mL，且随着石榴皮醇提物浓度的增加抑制率逐渐上升，说明这种抑制作用具有一定的剂量依赖性；同时，集落形成试验也证明石榴皮醇提物具有抑制肿瘤细胞克隆形成的能力，抑制肿瘤细胞的增殖，随着石榴皮醇提物浓度的增加克隆形成数减少，具有一定的剂量依赖性。细胞经1/2 IC50和IC50石榴皮醇提物处理48 h后，光镜下观察到细胞数目减少，细胞体积变圆，细胞核变小，有大量细胞碎片漂浮于培养液中。流式细胞仪检测提取物对细胞周期的影响与阴性对照组比较，细胞被阻滞于G0/G1期，这有可能阻断了细胞的生长、分裂，延长了细胞周期，从而起到抑制细胞增殖的作用[12]。

综上所述，石榴皮醇提物对人胃癌SGC-7901细胞具有明显的抑制作用，为接下来从醇提物中寻找具有高选择性、低毒性的化合物奠定了一定基础，为石榴皮的进一步开发与研究提供了一定的药理学依据。

[1]侯予红.新疆地区石榴研究进展[J].安徽农业科学，2014，42（12）：3600-3601.

[2]陆雪莹，李艳红，阿吉艾克拜尔·尔萨，等.石榴皮化学组分体外活性筛选及抗肿瘤机理的初步研究[J].时珍国医国药，2011，22（3）：599-601.

[3]杜欣，叶盛英.石榴叶和石榴皮药理活性研究进展[J].天津药学，2007，19（2）：64-66.

[4]热娜·卡斯木，帕丽达·阿不力孜，张笑颖.新疆石榴皮化学成分研究[J].中药材，2009，32（3）：363-365.

[5]姜婧，马桂芝，高晓黎.石榴皮醇提取物的初步毒理学研究[J].新疆医学，2010，40（3）：137-140.

[6]Ordoudi SA，Mantzouridou F，Daftsiou E，et al.Pomegranate juice functional constituents after alcoholic and acetic acid fermentation[J].J Funct Foods，2014，8：161-168.

[7]Albrecht M，Jiang W，Kumi-Diaka J，et al.Pomegranate extracts potently suppress proliferation，xenegraft，and invasion of human prostate cancer cells[J].J Med Food，2004，7（3）：274-283.

[8]姜婧.新疆石榴提取物抗肿瘤活性的基础研究[D].乌鲁木齐：新疆医科大学，2010.

[9]张玉梅，王家晓.石榴皮鞣花酸对4T1乳腺癌小鼠免疫功能的影响[J].现代中西医结合杂志，2014，23（15）：1597-1602.

[10]李进，李天明，高箬远.癌症的研究策略与方法[J].云南师范大学学报：自然科学版，2014，34（2）：75-78.

[11]苗蔚.第十五个世界癌症日到来及《世界癌症报告》发表[J].中华医学杂志，2014，94（12）：888.

[12]林敬明，刘煜，罗荣城.半枝莲提取物抗人肝癌Hep-G2细胞增殖及其机制研究[J].南方医科大学学报，2006，26（7）：975-977.

Effect of pomegranate peel granatoline extracts on proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells

Sun Zemin，Xu Xianlin，Ou Gangwei
（Department of Biochemistry，Zunyi Medical University，Guizhou，Zunyi 563099，China）

ObjectiveTo approach the effect of pomegranate peel granatoline extracts on proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells and its anti-cancer mechanisms.MethodsThe gastric cancer SCG-7901 cells were cultured in vitro and the pomegranate peel granatoline was prepared whose final concentration was 100，80，60，40，20，10 μg/mL respectively.Another negative control group was set up without given medicine（0 μg/mL）.It adopted MTT and cloning assays to observe and compare the effect of pomegranate peel granatoline of on proliferation and cloning capabilities of gastric cancer SGC-7901 cells.The morphologic changes of SCG-7901 cells acted by extracts for 48 hours were observed by inverted phase contrast microscope.The periodicvariationof SCG-7901cellstreated with extractsfor 48 hourswereanalyzed by flow cytometry（FCM）.ResultsThe pomegranate peel granatoline extracts displayed obvious inhibition effect on SCG-7901 cells，being distinctive concentration-dependent and time-dependent，and it significantly inhibited the formation rate of cells colony.Acted by different-concentration extract solution，the SCG-7901 cell numbers decreased with death of partial cells and karyopy knosis as well as the cell cycle changed.Compared with the negative control group，the ratio of S-phase cells was decreased and G0/G1-phase increased，as well as an obvious block in G0/G1phase.ConclusionThe pomegranate peel granatoline extracts may inhibit the proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells，preventing the cells from G1phase to S phase.

Pericarpium Granati/chemistry； Alcohols/pharmacology； Stomach Neoplasms； Cell Proliferation

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.06.010

：A

：1009-5519（2015）06-0826-03

2014-10-30）

贵州省科技厅基金项目（C-487）。

孙泽敏（1982-），女，贵州遵义人，硕士研究生，主要从事胃肠道肿瘤研究；E-mail：sunzeminzunyi@163.com。

欧刚卫（E-mail：gangwei.ou@zmc.edu.cn）。