医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Spa和SCCmec分型研究*

李艳萌，赵瑞珂，黄宝丽，张险峰，韩清珍，顾国浩，陈泽良，史进方△，徐 杰▲

(1.苏州大学附属第一医院检验科，江苏苏州 215006；2.军事医学科学院疾病预防控制所传染病控制中心，北京 100071)

·经验交流·

医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Spa和SCCmec分型研究*

李艳萌1，赵瑞珂1，黄宝丽1，张险峰1，韩清珍1，顾国浩1，陈泽良2，史进方1△，徐 杰1▲

(1.苏州大学附属第一医院检验科，江苏苏州 215006；2.军事医学科学院疾病预防控制所传染病控制中心，北京 100071)

目的 对医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(HA-MRSA)A蛋白(Spa)和葡萄球菌mec基因盒(SCCmec)分型同源性研究，为预防和控制医院感染提供依据。方法采用药敏纸片法(K-B法)、SCCmec分型及Spa分型技术，收集自2013年8月至2014年4月80株HA-MRSA，进行药敏试验和同源性分析，并检测毒力基因杀白细胞毒素(pvl)基因和毒性休克综合征(tsst)基因。结果药敏结果显示，80株HA-MRSA对青霉素、氨苄西林/舒巴坦、亚胺培南均耐药，对环丙沙星耐药率为90.0%，对克林霉素耐药率为58.8%，对复方磺胺类耐药率为13.8%，对万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁均敏感。SCCmec分型结果显示，80株MRSA中SCCmec Ⅱ型占73.75%、SCCmec Ⅲ型(13.75%)、SCCmec Ⅴ型(12.5%)。Spa分型，28株为t2460型(35%)、9株为t002型(11%)、6株为t030型(8%)、7株为t632型(9%)、5株为t037型(6%)，其他Spa型相对分散。pvl基因阳性率为7.5%(6株)，tsst基因为阴性。结论HA-MRSA SCCmec分型以Ⅱ为主，Spa分型以t2460型为主，有较高的同源性；HA-MRSA对多种药物具有较高的耐药性并且存在多重耐药。

交叉感染；葡萄球菌，金黄色；SCCmec分型；Spa分型；耐药性

自1961年英国学者Jevons发现首例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，MRSA已成为医院感染重要的致病菌。近年来，由于抗菌药物的滥用，MRSA已成为医院感染主要临床和流行病学问题，该菌抵抗力强，在医院环境中普遍存在，易感人群为频繁住院治疗、外科手术后、血液透析、长期护理、器官移植、肿瘤化疗等免疫功能低下的人群。近年来，在日本和美国，发现了对万古霉素中介(VISA)和耐药的金黄色葡萄球菌(VRSA)。本研究对医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌A蛋白(Spa)和葡萄球菌mec基因盒(SCCmec)分型同源性研究，为预防和控制医院感染提供依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 菌株来源及鉴定 收集苏州大学附属第一医院2013年8月至2014年4月临床送检标本分离的HA-MRSA 80株(无重复计入)，均经法国Bio-Merieux公司VITEKⅡCompact细菌自动鉴定仪进行鉴定，用甲氧西林药敏纸片初步判定MRSA，用PCR扩增mecA基因阳性来确定。质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923。

1.1.2 药敏纸片 有效期内用于抗菌药物体外敏感试验的药敏纸片：复方磺胺(25 μg)、氨苄西林(75 μg)/舒巴坦(30 μg)、亚胺培南(10 μg)、环丙沙星(5 μg)、青霉素(10 μg)、甲氧西林(30 μg)、万古霉素(30 μg)、克林霉素(30 μg)、利奈唑胺(30 μg)、替考拉宁(30 μg)均购自英国OXOID公司。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 采用纸片扩散法(K-B法)，结果参照2011版美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准，对80株医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(HA-MRSA)进行药物敏感性判定。

1.2.2 SCCmec分型及毒力基因杀白细胞毒素(pvl)、毒性休克综合征(tsst)基因检测 反应体系25 μL，退火温度为57 ℃，进行30个循环，各个基因的引物均由华大基因有限公司合成，引物序列[1-2]见表1。对毒力基因pvl、tsst、mecA、SCCmec分型，PCR产物凝胶电泳根据条带长度进行判定。

表1 本研究所用引物

续表1 本研究所用引物

1.2.3 Spa分型 Spa分型是利用金黄色葡萄球菌蛋白A的X区中含有的24 bp重复序列，重复序列首端为相对保守区域[3]，利用这种基因的多态性建立的分型方法。参照引物1095F：5′-AGA CGA TCC TTC GGT GAG C-3′，1517R：5′-GCT TTT GCA ATG TCA TTT ACT G-3′。PCR反应条件：95 ℃预热10 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环，然后延伸10 min[4]。PCR产物送往北京六合华大基因科技有限公司测序，根据测序碱基序列对应Spa分型数据库进行分型。

2 结 果

2.1 药敏结果 80株HA-MRSA菌株mecA基因PCR扩增阳性同时对甲氧西林耐药，青霉素、氨苄西林/舒巴坦均耐药，对环丙沙星耐药率达90%；对克林霉素相对敏感，耐药率为58.8%；对复方磺胺类敏感，耐药率仅为13.8%；对万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁全敏感(表2)。

表2 80株HA-MRSA对抗菌药物的耐药率[n(%)]

2.2 SCCmec分型和毒力基因pvl、tsst的结果 80株HA-MRSA，其中，59株扩增出398 bp的条带，为SCCmecⅡ型(73.75%)；13株扩增出280 bp的条带，为SCCmec Ⅲ型(13.75%)；10株扩增出325 bp的条带，为SCCmec Ⅴ型(12.5%)，见图1。SCCmecⅠ、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd均未扩增出条带。毒力基因检测中，6株扩增出433 bp的条带，为毒力基因pvl(7.5%)，tsst基因全为阴性。

2.3 Spa分型 Spa分型的PCR的产物由北京六合华大基因科技有限公司测序，Spa基因检测按官方网站Ridom SpaServer(http://spa.ridom.de/index.shtml)对结果进行比对分析确定类型。80株MRSA经比对分析确定19种分型，28株为t2460，9株为t002，6株为t030，7株为t632，5株为t037，t311、t437分别为3株，t163、t264、t211、t4549、t2310、t279、t164分别为2株，其他类型为1株(图2)。

M：DNA Marker D2000(100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1 000 bp、2 000 bp)；1～17：SCCmec Ⅱ(398 bp)；18～30：SCCmec Ⅲ(280 bp)；31～40：SCCmec Ⅴ(325 bp)。

图1 SCCmec分型PCR电泳图

图2 80株HA-MRSA Spa分型构成

2.4 Spa分型、SCCmec分型与抗菌药物耐药率的关系分析 Spa分型具有高度的一致性，除t002、t030、t2460分型中的克林霉素耐药率有差异，其他型都有相同的耐药率和SCCmec型；在SCCmec分型中，抗菌药物的耐药率也呈现高度的一致性。SCCmecⅡ型，对复方磺胺类均敏感，对克林霉素相对敏感，对环丙沙星耐药；SCCmec Ⅲ型对复方磺胺类、克林霉素和环丙沙星均耐药；SCCmecⅤ型对复方磺胺类、克林霉素和环丙沙星均敏感(表3)。

表3 Spa分型、SCCmec分型与抗菌药物耐药率分析

3 讨 论

金黄色葡萄球菌是引起侵袭性化脓性感染最常见的病原菌，也可引起内脏器官感染，如肺炎、脓胸、心包炎等。金黄色葡萄球菌毒力强、抵抗力强，同时由于抗菌药物的滥用，耐药性也越来越强。因此，积极检测HA-MRSA感染与流行情况和耐药特点，具有重要意义。

PVL是一种破坏白细胞膜钻孔的毒素，含有pvl基因的金黄色葡萄球菌与胶原和黏蛋白有较强的亲和力，使金黄色葡萄球菌更易于粘附并破坏呼吸道上皮，引起严重的坏死性肺炎。本研究中，80株HA-MRSA pvl阳性率仅为7.5%，与已有的研究[5]报道pvl基因HA-MRSA中阳性率不高相一致，这可能是由于HA-MRSA毒力基因容易丢失、致病力相对较弱导致的。而在社区获得性MRSA(CA-MRSA)中pvl阳性率高，约占75%[6]。同时，pvl与SCCmec基因盒相互关联。许多研究[7]显示CA-MRSA中的pvl阳性率高于HA-MRSA。tsst是金葡菌产生的一种中毒性休克的外毒素，增加内毒素的敏感性，增强毛细血管通透性，主要见于MRSA中[8]，本实验中tsst基因全为阴性。

SCCmec分型主要以近年来发现，编码PBP2a的mecA基因不是独立存在的，而是以基因岛的形式存在，称为葡萄球菌mec基因盒，它不但含有编码PBP2a的mecA基因，还吸引和整合了多种外源性的耐药基因、转座子和插入序列等，从而使MRSA的耐药性不断积累，呈现多重耐药。MRSA对青霉素类、内酰胺/内酰胺抑制剂复合物、头孢类、碳青霉烯类均耐药，对大环内酯类、喹诺酮类、氨基糖苷类抗菌药物成交叉耐药。SCCmec可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型，本院分离的80株HA-MRSA主要以SCCmecⅡ型为主，占73.75%，其次为SCCmecⅢ型(13.75%)、SCCmecⅤ型(12.5%)。SCCmec基因型与耐药谱有着密切的关系，SCCmecⅡ、Ⅲ内含有耐药基因的质粒或转座子，呈现多重耐药。本研究药敏分析结果显示，SCCmecⅡ型对复方磺胺类全敏感，对克林霉素相对敏感，对环丙沙星均耐药；SCCmecⅢ型中对大环内酯类、喹诺酮类、复方磺胺类抗菌药物均耐药；SCCmecⅤ型对大环内酯类、喹诺酮类、复方磺胺类抗菌药物均敏感。

曹江红等[9]报道称HA-MRSA主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，CA-MRSA主要是Ⅳ、Ⅴ型。魏军等[10]报道主要是SCCmec Ⅲ型居多，而本研究中以SCCmecⅡ居多，可见HA-MRSA有一定的地域差异。实验中的SCCmecⅤ型(12.5%)的标本多来自门诊患者，同时有5株为pvl阳性，可能来源为CA-MRSA。

Spa基因分型是一种基于spa基因中X区24 bp的高度可辨重复序列分型技术，该分型方法具有快速、易于操作、重复性好等优点。本研究应用Spa分型方法，研究细菌的基因型和各种表型之间的关系，可以分为19种Spa类型，其中28株为t2460型，9株为t002型，6株为t030型，7株为t632型，5株为t037型。部分相同类型的菌株来自同一病区的不同患者，其中28株t2460中有8株来自呼吸ICU，6株来自普外科，9株t002中有3株来自呼吸科，可能为医院内部菌株的传递和感染；其他的类型比较分散，可能来自外界的菌株。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2015.34.024

国家重大传染病专项基金资助项目(2009zx10004-205)；江苏省卫生厅医学科研基金资助项目(Q201401)；江苏省研究生培养创新工程基金资助项目(KYLX_1261)。

：李艳萌(1986-)，在读硕士，主要从事临床细菌耐药与致病机制研究。△

，Tel：13584843130；E-mail:szsjf2006@126.com。▲通讯作者，Tel：15862384571；E-mail：xuj2007@lzu.edu.cn。

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1671-8348(2015)34-4821-04

2015-05-08

2015-07-05)