鸡马立克氏病液氮活疫苗的不同稀释方法对疫苗病毒滴度的影响

郭 靖，贺生芳，齐田苗，闫丰超，边海霞

（1.宁夏晓鸣农牧股份有限公司，宁夏 银川750000；2.宁夏家禽工程技术研究中心）

鸡马立克氏病（MD）是由马立克氏病病毒（MDV）引起的鸡高度接触性淋巴细胞增生性疾病，是严重危害家禽的传染病之一。目前活疫苗仍然是预防该类疾病的主要手段，自HTV 疫苗研究出到现在，以及生产出几种商品化疫苗，但是马立克氏病还是不断频发，给养禽业造成巨大经济损失。疫苗免疫是有效预防该疾病发生的手段，但是免疫的雏鸡发生马立克氏病的概率目前不断上升，导致现状的因素有毒株的不断进化，免疫失败，疫苗质量，饲养管理等许多方面。本文针对MD 液氮疫苗在现场免疫的方法进行细胞模拟试验，比较分析在使用疫苗过程中应该如何避免免疫失败。

1 材料与方法

1.1 试验材料

9日龄SPF 鸡胚由宁夏大学提供，MD 液氮活疫苗（2 000 羽份）以及配套稀释液分别由A、B、C厂家提供，细胞培养M199、胎牛血清、0.25%胰酶均购自Hyclone公司；细胞六孔板购自康宁公司。

1.2 鸡胚成纤维原代细胞（CEF）和次代细胞的制备

按照常规方法用9日龄的鸡胚制备CEF 单层细胞，用0.25%胰酶消化，之后制备成每毫升细胞生长液含有150万个左右的悬液均匀的铺于六孔板之内。在37 ℃下培养，待24h形成致密的良好单层用于接种疫苗毒。

1.3 接毒

将保存在液氮中的A 厂家MD 液氮活疫苗疫苗迅速置于水浴锅内，缓和27 ℃溶解，溶解时间控制在1min之内，分别用疫苗配套专用稀释液稀释，先用一次性注射器吸取疫苗原液注入稀释液中，摇匀，从中吸取1mL疫苗稀释液混合液洗疫苗瓶2～3次之后（疫苗瓶帽也要洗涤），之后分四种方法。（1）从混合稀释液上1／3处三个点各取1mL，混匀，从中吸取1mL加入9mL稀释液中混匀（稀释度为10-3），重复1次稀释至10-4；（2）从混合稀释液中间1／3处三个点各取1 mL，混匀，从中吸取1 mL加入9mL 稀释液中混匀（稀释度为10-3），重复1次稀释至10-4；（3）从混合稀释液下1／3 处三个点各取1mL，混匀，从中吸取1mL加入9mL稀释液中混匀（稀释度为10-3），重复1次稀释至10-4；（4）从上、中、下三点各取1mL混匀，从中吸取1mL加入9mL稀释液中混匀（稀释度为10-3），重复1次稀释至10-4。将其他两个厂家的疫苗用37 ℃溶解后也做同样处理，之后取各个疫苗的4种不同吸取方法制备的10-4滴度的疫苗接种3 个已长成良好单层细胞的六孔板中，每个孔加200μL（1羽份），另外设两孔加入200μL 疫苗专用稀释液做为空白细胞对照，在所有孔中加入5 mL 1% M199培养基，培养5～6d，期间减少培养板的移动。另外，将A、B、C三个厂家的疫苗如上面介绍的方法进行10-2的稀释，之后首先以第四种方法进行10-4倍的稀释，接种3个已长成良好单层细胞的六孔板中，之后将疫苗稀释瓶静止20 min，之后再次混匀，接种3个已长成良好单层细胞的六孔板中，每个孔加200 μL，另外设两孔加入200μL 疫苗专用稀释液做为空白细胞对照，在所有孔中加入5mL 1% M199培养基，培养5～6d，期间减少培养板的移动。

1.4 蚀斑计数、疫苗病毒滴度计算

空白对照细胞应长势良好，细胞形态正常，无空斑化现象。以10-4稀释度测定孔计数，结果计算3个孔的平均蚀斑数目，再计算出疫苗检测样品所含蚀斑数。疫苗样品病毒滴度计算为：

（X1＋X2＋X3）／3＊100＝最终PFU／羽。

1.5 统计方法

采用SPSS 11.5分别计算3类疫苗不同部位稀释的MD 液氮活疫苗在CEF 细胞上形成的平均蚀斑数目（平均值±标准偏差）之间的差异显著性检验，以及各部位病毒滴度的差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 三个厂家MD 液氮活疫苗在CEF细胞中形成蚀斑形态

在10-4倍稀释的MD 疫苗接种次代CEF 单层，37 ℃培养5～6d 之后，倒置显微镜下观察蚀斑，疫苗病毒引起的蚀斑形态为细胞成球状簇团成葡萄状，折光性变强，如图1。

图1 MD 液氮疫苗CEF蚀斑

2.2 三个厂家疫苗各3种不同部位形成的蚀斑数以及病毒滴度

如表1所示，A 厂家MD 液氮活疫苗在经稀释之后中间部位疫苗的病毒滴度显著高于其他两个部位（P＜0.05），B 厂家MD 液氮活疫苗在经稀释之后中间部位疫苗的病毒滴度显著高于其他两个部位（P＜0.05），C 厂家MD 液氮活疫苗在经稀释之后中间部位疫苗的病毒滴度显著高于其他两个部位（P＜0.05），3类疫苗上、下、上中下三个部位的疫苗的病毒滴度间差异不显著（P＞0.05）。

2.3 不同时间段三个厂家MD 液氮活疫苗CEF蚀斑数以及病毒滴度

如表2所示，三类厂家疫苗在前、后20min的疫苗在CEF细胞上形成的平均蚀斑数目差异不显著（P＞0.05）。图3所示三类厂家的MD 液氮活疫苗前20min与后20min的病毒滴度之间差异不显著（P＞0.05）。

表1 各MD 液氮疫苗各个部位测得的病毒CEF蚀斑数

图2 各MD 液氮疫苗各部位病毒平均滴度

表2 各MD 液氮疫苗不同时间测得的病毒CEF蚀斑数

图3 各MD 液氮疫苗不同时间段病毒平均滴度

3 讨论

目前，常常存在雏鸡接受MD 液氮活疫苗之后产生的免疫应答不强烈，达不到有效的保护水平，引起鸡体免疫失败，导致发生马立克氏病，引起免疫失败的原因有很多方面。从本试验研究结果分析，我国对于MD 的疫苗免疫目前都是一日龄进行，就可达到终生免疫的效果。因此，保证一日龄免疫成功是终生能有保护力的基础，在进行雏鸡疫苗免疫时，疫苗的稀释方法是很关键的一步，必须保证免疫的每只雏鸡接受的疫苗病毒含量一致，这样才能保证疫苗对于每只雏鸡产生免疫保护力，可以有效防止野毒的侵害。在现场免疫时，由于不同的工作人员与不同的工作意识，导致在稀释疫苗时没有充分使之处于均匀的状态，雏鸡接受的疫苗病毒含量达不到有效的保护力，导致该疾病的发生。因此，在规模化养殖场中，必须严格规范免疫方法，提高免疫意识，做好免疫的关键步骤，只有这样才能保证疫苗使用恰当，保证雏鸡能产生有效的免疫力。

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