冠心病患者血小板表面EMMPRIN 表达与冠脉病变的关系

方日亮，杨丽霞，郭瑞威，李文琴，齐 峰，叶金善

近年来，冠状动脉疾病的发病率呈逐年上升趋势，其中，急性冠脉综合征（ACS）是冠脉病变死亡率最高的一类，其发生、发展机制复杂，主要是在冠脉粥样硬化的基础上，由于炎症反应等多因素导致冠脉内斑块破裂和(或)形成溃疡，并在此过程中伴有血栓形成，从而导致管腔完全或不完全阻塞，进而造成心肌缺血或坏死引起一系列的综合反应[1]。 这一过程中，血小板活化容易导致血液黏附、聚集，致血管血栓形成。 细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN）是一种高度糖基化跨膜蛋白，与血小板活化密切相关， 进而可刺激基质金属蛋白酶的产生，影响冠状动脉粥样硬化斑块的稳定性。 研究显示， 在载脂蛋白E 敲除小鼠的动脉粥样硬化模型中， 主动脉粥样硬化斑块中EMMPRIN 表达明显升高[2]，但其在血小板表面的表达尚不清楚。 P-选择素主要存在于血小板α 颗粒膜蛋白及血管内皮细胞的Weibel-Palade 小体内，对炎症反应的启动，以及白细胞在内皮上黏附、聚集和血栓形成等过程均起到重要作用，已经被明确为冠脉病变的炎症标志物和介导物。 本研究对冠心病患者血小板表面EMMPRIN 表达水平和血清P-选择素表达水平进行分析，探讨两者与冠脉病变的关系及临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2014 年3～9 月在我科住院的冠心病患者138 例，男87 例，女51 例，年龄39～81(60.3±7.0)岁。根据ACC/AHA 诊断标准分为：稳定性心绞痛（SAP）52 例，不稳定心绞痛（UAP）30 例，急性心肌梗死（AMI）56 例；另选择40 例与上述患者年龄和性别相当、冠脉造影结果正常者作为对照组。 所有研究对象均排除患有心力衰竭、病毒性心肌炎、扩张性心肌病、风心病、外周血管病，以及合并肝肾功能不全、DIC、肿瘤、免疫疾病和血液系统疾病等疾病。

1.2 冠状动脉造影 所有冠心病患者均行冠状动脉造影检查，采用Judkin 技术，根据造影结果，由影像医师以目测法评估病变部位性质及狭窄程度。 根据冠脉病变累及支数，分为单支病变组、双支病变组和多支病变组。

1.3 标本的采集及制备 所有冠心病患者于冠脉造影时抽取桡动脉血液10 ml （对照组由体检中心抽取），5 ml 置于1∶9 枸橼酸钠抗凝管中，加多聚甲醛固定，室温下800 r/min 离心10 min；取上清富含血小板血浆入3 ml 离心管内， 加入等体积的HEPES 改良台式液，2500 r/min 离心10 min， 弃上清，得到血小板待检；将枸橼酸钠抗凝管中剩余的5 ml 全血于30 min 内离心取血清，于-80 ℃冰箱保存，待检。

1.4 检测指标 采用库尔特公司EPICS XL 型流式细胞仪测血小板表面EMMPRIN 的表达水平，用平均荧光强度(MFI)反映其表达强弱；ELISA 法检测血清P-选择素水平，试剂盒由上海森雄科技实业有限公司生产，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件对数据进行分析。 计量数据以表示， 两组比较采用LSD-t 检验，3 组比较采用方差分析；采用Pearson 法分析相关性，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冠心病组与对照组EMMPRIN、P- 选择素比较冠心病组血小板表面EMMPRIN 表达水平、血清P-选择素水平显著高于对照组（P ＜0.01，表1）。

表1 冠心病组与对照组EMMPRIN、P-选择素比较

2.2 不同冠心病病情程度患者EMMPRIN、P- 选择素比较 AMI 组、UAP 组、SAP 组3 组间比较，EMMPRIN 表达水平 （F =168.392，P < 0.01） 和P-选择素水平（F = 97.409，P < 0.01）均有统计学意义，均是AMI 组最高，UAP 组次之，SAP 组最低，见表2。

表2 不同冠心病病情程度患者EMMPRIN、P-选择素比较

2.3 冠脉病变不同支数间EMMPRIN、P- 选择素比较 随冠脉病变支数增加， 血小板表面EMMPRIN表达水平、血清P- 选择素水平显著增加（P ＜0.05 或P ＜0.01，表3）。

表3 冠脉病变不同支数间EMMPRIN、P-选择素比较

2.4 EMMPRIN 与血清P- 选择素间的关系 直线相关分析结果显示， 冠心病患者血小板表面EMMPRIN 表达水平与血清P-选择素水平呈正相关（r =0.596，P ＜0.01）。

3 讨论

本研究结果表明, 冠心病患者血小板表面EMMPRIN 表达水平明显高于对照组， 其发生机制可能是由于动脉粥样硬化所引起的血管和毛细血管内皮细胞损伤，使位于血管受损或内皮暴露部位的血小板与内皮下基质直接接触、发生黏附，引起血小板活化、聚集。 而迅速激活的血小板进一步活化内皮细胞，改变内皮细胞黏附和渗出活性；另一方面血小板可通过释放潜在的炎症或促有丝分裂底物改变内皮细胞的黏附、 趋化和蛋白水解活性，使白细胞黏附并转移到炎症组织，从而加快冠脉粥样硬化形成过程[3]。 由此可见，活化血小板和炎症反应与急性冠脉综合征的发生关系密切。

EMMPRIN 是一种高糖基化跨膜蛋白,属于免疫球蛋白家族。 研究发现，EMMPRIN 主要是通过调节基质金属蛋白酶（MMPs），促进动脉粥样硬化斑块中MMPs 表达增加， 致降解AS 斑块纤维帽的能力增强，进一步使纤维帽变薄甚至破裂，最终导致急性冠脉事件的发生[4]。 近年研究发现，EMMPRIN 是血小板表面受体之一， 当血小板活化时，EMMPRIN表达水平随之上调； 且EMMPRIN 与血小板结合后能够诱导血小板活化和脱颗粒作用； 此外，EMMPRIN 可通过激活血小板, 参与炎症反应过程，参与冠脉粥样硬化的形成和发展过程[5]。 研究发现，共同孵育血小板和单核细胞可诱导单核细胞EMMPRIN 介导的NF-κB 途径激活， 并促进基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及其他炎症因子的分泌增加，从而加速冠脉粥样硬化的形成过程，促进急性冠脉综合征的发生[6]。 本研究结果显示，在冠心病患者中，AMI 组和UAP 组血小板表面EMMPRIN 表达水平明显高于SAP 组，且AMI 组较UAP 组增加明显；随冠脉病变所累及支数的增加，其表达水平显著增加（P ＜0.05 或P ＜0.01）。 说明随着冠心病患者病变程度和病变范围的增加， 血小板表面EMMPRIN表达水平明显增加，这表明活化血小板及其表面受体的变化与冠脉病变关系密切。

P-选择素是整合素家族成员的一部分， 主要存在于活化血小板和血管内皮细胞， 在白细胞招募到斑块破裂的过程中， 作为炎症反应的介质发挥了关键性的作用，对于早期识别ACS 具有重要意义[7]。 本研究结果显示， 冠心病患者血清P-选择素表达水平明显高于对照组，在冠心病患者中，AMI 组和UAP组血清P- 选择素表达水平较稳定性心绞痛组明显升高，AMI 组较UAP 组升高显著， 而随冠脉病变累及支数的增加， 其表达水平增加显著（P ＜0.05 或P ＜0.01）。 说明随着冠心病患者病变程度和病变范围的增加，血清P-选择素表达水平明显增加，这表明血清P-选择素参与了冠心病的病理发展过程， 并与冠脉病变的严重性密切相关。 活化血小板及内皮细胞可通过表达P-选择素， 并通过与循环中单核细胞上相应的配体结合引起NF-κB 的核转位， 促使其编码的黏附分子及炎性介质大量表达， 从而促进局部炎症反应进一步诱发血栓形成，从而形成恶性循环[8-9]。 在本研究相关性分析显示， 血小板表面EMMPRIN 表达水平与血清P- 选择素水平呈正相关（r = 0.596，P ＜0.01），也说明了两者在冠脉病变过程中可能存在的促进作用。 近年研究发现[10]，作为"炎症细胞"的血小板，在动脉粥样斑块不稳定性病变演变过程中发挥重要作用，这也进一步反映两者表达水平的变化与冠心病患者冠脉病变的类型和病变程度的关系密切。

因此，临床对冠心病患者早期进行血小板表面EMMPRIN 表达、血清P-选择素水平检测，有助于筛查高危患者，并采取有效的干预措施，对ACS 的早期诊断提供新的依据，对于冠心病患者冠脉硬化的发生、发展以及疾病疗效和预后观察都具有重要的临床意义。

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