响应面优化野生樱桃李叶总黄酮的超声辅助提取工艺

刘 伟，何晓燕，陈文强，朱 燕，代思月，欧阳艳

新疆维吾尔自治区普通高校天然产物化学与应用重点实验室 伊犁师范学院，伊宁 835000

野生樱桃李(Prunus divaricataLdb.)，俗称野酸梅，蔷薇科李属，落枝灌木或小乔木。植株高1.5～8.0 m，多分枝，枝条细长，开展形，叶繁茂，深绿色［1］，主要分布于中亚天山、高加索、小亚细亚及巴尔干半岛，在我国仅分布于新疆伊犁霍城县的大西沟和小西沟［2］。本地哈萨克牧民长期食用樱桃李果酱或将果实晒干泡茶饮用，高血脂及高血压患者较少，因此野生樱桃李被誉为“雪域珍果”［3］，具有天然的保健功能和开发前景。国内学者对野生樱桃李的研究多集中在生态、栽培及果实营养成分等方面，对其有效成分的提取与活性研究近年来才逐步开展，其中野生樱桃李果皮色素和果肉总酚提取物均表现出了较好的抗氧化活性［4，5］。黄酮类化合物是植物花、叶等器官中的重要次级代谢产物，在心血管病治疗、抗病毒、抗肿瘤、保肝、抑菌、抗衰老等方面有着广泛的用途［6］。超声波辅助提取是利用超声波的空化效应、热效应和机械作用来加快物质的溶出，缩短提取时间，提高提取效率［7］。近年来，超声辅助提取技术广泛应用于提取天然产物有效成分黄酮、生物碱、三萜等研究领域中［8，9］。本文采用超声辅助提取的方法，在单因素试验基础上，结合响应面法优化野生樱桃李叶总黄酮的超声辅助提取工艺，以期为野生樱桃李资源的利用与开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料与试剂:野生樱桃李树叶于新疆伊犁霍城县大西沟10月份采摘，经伊犁师范学院资源与生态研究所赵玉副教授鉴定为蔷薇科野生樱桃李叶，洗净自然晾干后50 ℃烘干至恒重，粉碎过60 目筛备用，树叶标本存放于伊犁师范学院资源与生态研究所。芦丁标准品，国药集团化学试剂有限公司(批号:65011360);亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、氯化铝、无水乙醇均为分析纯。

仪器:UV-2550 紫外可见分光光度计(日本岛津分析仪器厂);XH-2008D 智能温控低温超声波催化合成仪(北京祥鹄科技发展有限公司);DD-5M 型低速离心机(湘仪离心机有限公司);FA2104 电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);BAO-150AG型电热恒温干燥箱(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

为避免含邻二酚类化合物对总黄酮含量测定的干扰，参照文献［10］，选用对黄酮类化合物专属性较强的AlCl3法测定样品总黄酮含量。精确称取芦丁标准品25.0 mg，用少量的60%乙醇溶液溶解后定容于100 mL 容量瓶中，摇匀得0.25 mg/mL 的芦丁标准溶液，备用。精密移取上述芦丁标准溶液0.0、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，分别加入盛有5.0 mL 60%乙醇溶液的25 mL 相同规格的容量瓶中，再加0.1 mol/L AlCl3溶液2.0 mL，用60%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置15 min，以加入0.0 mL 芦丁的溶液为空白对照，于417 nm 处测定吸光值。以芦丁标准溶液质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线得y=27.93619x+0.0023，R2=0.9999，结果表明在浓度8.0 μg/mL 至18.0 μg/mL范围内两变量呈现良好的线性关系。

1.2.2 野生樱桃李叶总黄酮提取单因素试验

精密称取1.0000 g 的备用野生樱桃李叶，固定料液比1 ∶30 g/mL、提取温度70 ℃、提取时间30 min，考察不同乙醇体积分数(30%、40%、50%、60%、70%)对总黄酮提取的影响;其它条件不变，设定试验所得最适乙醇体积分数，考察不同提取温度(40、50、60、70、80 ℃)对总黄酮提取的影响;按照上述方法依次考察超声提取时间(10、20、30、40、50 min)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL)对总黄酮提取的影响;上述试验均在300 W 功率下超声提取2 次，合并提取液，将提取液4000 rpm 离心10 min，取上清液定容待测。精密移取1.0 mL 定容后的溶液按照1.2.1 方法测定总黄酮含量，重复3 次取平均值。

式中:Y为总黄酮含量(mg/g)，k待测液与测试液体积之比，c为标准曲线法计算所得浓度(mg/mL)，V为测试液定容的体积(mL)，m为野生樱桃李叶质量(g)。

1.2.3 响应面设计

在单因素试验的基础上，以总黄酮提取量为响应值，选取乙醇体积分数(A)、提取温度(B)、料液比(C)为自变量，采用Box-Benhnken 设计三因素三水平试验，因素水平设计见表1，利用Design-Expert.8.05 软件对实验数据进行分析。

表1 响应面试验因素及水平表Table 1 Factors and levels of RSM test

1.2.4 超声辅助提取法与传统索氏提取法效果比较

准确称取1.0000 g 的备用野生樱桃李叶，分别采用超声辅助提取法(在响应面优化的最佳工艺参数进行)，传统索氏提取法(与超声提取相同的提取溶剂和料液比，微沸状态提取4 h)，考察不同提取方法对野生樱桃李叶总黄酮提取的影响。

2 结果与分析

2.1 不同提取条件下单因素试验结果

图1 乙醇体积分数(a)、提取温度(b)、超声时间(c)及料液比(d)对总黄酮提取量的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration (a)，extraction temperature (b)，ultrasonic time (c)and solid-liquid ratio (d)on extraction yield of total flavonoids

由图1a 可知，当乙醇体积分数小于50%时，野生樱桃李叶总黄酮提取量随着乙醇体积分数的增大而增高。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态(苷元)的形式存在。推测原因为野生樱桃李叶中黄酮苷类物质较多，黄酮苷水溶性较好，当以极性较大的溶剂提取时效果较好。试验过程中发现当乙醇体积分数大于60%时，所得提取溶液颜色明显加深，在417 nm 的紫外吸收值会突然增大。有文献报道乙醇浓度是影响色素提取的显著因素［11］。当提取溶剂浓度大于60%时野生樱桃李叶中的色素、糖类等物质会溶于溶剂中，影响了黄酮类化合物的浸出，干扰因素也随之增大。因此，选择50%乙醇为最适宜提取溶剂。由图1b 可知，当提取温度在40～70 ℃之间，提取温度与总黄酮提取量呈正相关性，可能是温度升高加剧了黄酮分子之间碰撞频率，植物细胞更容易破裂，加快了黄酮类化合物的溶出。当提取温度超过70 ℃后，总黄酮提取量有所降低，可能是温度过高对野生樱桃李叶中总黄酮的组织结构有所破坏，与李楠等［12］报道一致;此外，在80 ℃时溶剂易挥发也会影响总黄酮的提取效果。因此选择提取温度为70 ℃为宜。由图1c 可知，当超声时间在30 min 之前，总黄酮提取量随时间的延长增加显著，之后略有下降。可能是由于超声波的强振动、强空化效应等对植物细胞壁的破坏作用，加快了细胞内容物的溶出［13］。随着超声时间的延长，植物细胞膜会进一步被破坏，其中的粘液等杂质溶出使提取液粘度增大，影响提取效果。因此选择30 min 为适宜提取时间。由图1d 可知，总黄酮的提取量随着料液比的增加呈现先快速增长而后下降的趋势。增加提取溶剂用量，可以使物料与溶剂充分接触，同时可以增加传质动力，从而有助于总黄酮的溶出。当料液比达到1∶40 g/mL 后，总黄酮提取量有所下降，可能是溶剂过多，在超声作用下野生樱桃李叶中其它成分溶出，影响了总黄酮的提取。考虑到溶剂成本，选择1∶40 g/mL 为适宜料液比。

2.2 响应面分析优化总黄酮提取工艺

在单因素验验基础上，固定提取时间，以乙醇体积分数(A)、提取温度(B)、料液比(C)为自变量，以总黄酮提取量为响应值，设计17 次试验，其中析因部分试验12 次，中心点重复试验5 次，结果见表2。

实验以随机次序进行，利用Design-Expert 8.05软件对数据进行多元回归拟合，得到以总黄酮含量Y为目标函数:Y=38.18 +0.38A+0.65B+1.15C+0.47AB+0.095AC+0.15BC-2.17A2-0.91B2-0.63C2。

对上述模型进行方差分析，结果见表3。由表3可知，总模型F值为31.31，表明模型显著;模型P＜0.0001，响应面回归模型达到极显著水平。线性项、二次项及交互项AB 的P值＜0.05，表明其对总黄酮提取量影响显著;其它交互项AC 与BC 显著性较差，表明总黄酮提取量与自变量非简单的线性关系;模型失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率［14］，模型中失拟项P值为0.1122 ＞0.05，表明数据拟合效果较好，模型选择合适。模型变异系数CV 值为1.07，说明模型稳定性好;模拟方程的相关系数说明实验误差较小，可以利用该模型预测上述提取条件对总黄酮提取量的影响。三个试验因素对响应值的影响顺序为C ＞B ＞A。

表2 Box-Behnken 试验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design and result

表3 回归方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

注:差异极显著，＊＊P ＜0.01，差异显著，* P ＜0.05。Note:very significance different，＊＊P ＜0.01，significance different，* P ＜0.05.

响应面图形能较直观地反映出各因素对响应值的影响，等高线的形状可以反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反［14］。图2 分别显示了3 组试验参数以总黄酮提取量为响应值的趋势图。其中料液比(C)对总黄酮提取量的影响最为显著，乙醇体积分数(A)与提取温度(B)的交互作用最为显著，表现的等高线最扁平;乙醇体积分数(A)和料液比(C)的交互作用最小，与模型方差分析结果一致。在实验考察范围内，总黄酮提取量随乙醇体积分数、提取温度、料液比自变量的增大均呈现出先增大后减小的趋势，表明三个自变量过高或过低都不利于总黄酮的提取。

由Design-Expert 8.05 软件分析得到总黄酮最佳提取条件为乙醇体积分数50.80%、提取温度72.38 ℃、料液比1∶44.91 g/mL，理论总黄酮提取量为38.93 mg/g。为方便操作，总黄酮最佳提取优化工艺参数调整为乙醇体积分数51%、提取温度72℃、料液比1∶45 g/mL。

图2 不同自变量交互作用对总黄酮提取量影响的响应面Fig.2 Response surface plots showing the interaction of different independent variables on yield of total flavonoids

2.3 超声辅助提取法与传统提取法效果比较

以51%的乙醇为提取溶剂，固定料液比为1∶45 g/mL，采用超声辅助法在72 ℃下提取30 min，提取2 次，合并提取液，离心，定容，测定总黄酮含量。重复3 次，所得总黄酮含量平均值为38.27 mg/g，与理论值基本一致。这表明响应面法优化超声辅助提取野生樱桃李叶中总黄酮的提取工艺准确可靠，具有一定的实用价值。相比传统索氏提取法(总黄酮提取量平均值为35.59 mg/g)大大缩短了提取时间，提高了效率。索氏提取在高温下随着提取时间延长，树叶中非黄酮类物质也会逐渐溶出，对后续的总黄酮含量检测带来不便。

3 讨论

超声辅助提取结合响应面法在优化植物有效成分的提取工艺中已得到广泛应用［15］。传统的索氏提取法耗时长，有效成分长时间在高温提取环境中易被破坏。试验表明，超声辅助提取野生樱桃李叶中总黄酮较传统的索氏提取法效率高，后续操作简单，提取效果好。野生樱桃李叶总黄酮的提取工艺研究还未见报道，本文在单因素试验基础上进行三因素三水平Box-Behnken 试验设计，利用响应面分析法优化野生樱桃李叶总黄酮提取条件。结合实际可操作性得出较优工艺条件为乙醇体积分数51%、提取温度72 ℃、料液比1∶45 g/mL，在300 W 功率下超声提取30 min，提取次数2 次，优化后的试验结果与理论预测值基本一致。该方法耗时短，操作方便，提取效率高，为野生樱桃李叶黄酮类化合物的开发利用提供了理论依据。

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