王晓博 ,杜 阳,谢耀光,高明川,李海兰,王 波,姜 涛*
1大连医科大学生物技术系;2 大连医科大学病理学教研室,大连 116044
表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)是绿茶中的主要成分,是茶多酚中含量最多的单体物质。EGCG 是特定的黄烷醇类化合物,具有较强的抗氧化活性。细胞内超氧化物(,H2O2等)在代谢过程中堆积过多,不能及时清除是细胞衰老机制之一[1-3]。EGCG 是否可以通过它的抗氧化活性来抑制机体衰老过程,这是本研究需要探讨的问题。另外,细胞衰老与体内衰老相关的基因表达调控相关,其中包括炎症相关的转录因子NF-κB (nuclear factor kappaB,NF-κB)[4,5]。NF-κB 是一种具有转录激活功能的蛋白质,其与细胞凋亡的关系密切[6,7],但最近研究发现NF-κB 的激活与细胞衰老也密切相关。2013 年,发表在Nature 上的一篇文章表明:随着小鼠的衰老,下丘脑区域的NF-κB 逐渐被激活,证实了衰老与NF-κB 信号途径的相关性[8]。本研究拟通过分析EGCG 的抗衰老作用以及对衰老小鼠脑组织NF-κB 及相关分子的表达的影响,确定EGCG 与炎症相关信号通路之间的关系,为进一步研究EGCG 复杂的生物学效应提供线索。
3~4 月龄清洁级雄性昆明小鼠20 只,体重50±10 g,由大连医科大学SPF 实验动物中心提供。随机分为2 组,模型组和对照组。其中模型组15只,按照50 mg/(kg·d)颈背部皮下注射5%D-半乳糖生理盐水溶液,对照组5 只小鼠,按照1 mL/(kg·d)颈背部皮下注射生理盐水溶液,连续注射9 w。建模成功后,将模型组小鼠随机分为二组,衰老组和EGCG 处理组。衰老组5 只,按照1 mL/(kg·d)颈背部皮下注射生理盐水;EGCG 处理组10 只,以1 mg/(kg·d)皮下注射EGCG 生理盐水溶液,连续注射5 w;另领取3~4 月龄清洁级雄性昆明小鼠5 只设为年轻组。因此,最后利用年轻组小鼠5 只、衰老组小鼠5 只以及EGCG 处理组小鼠10 只进行研究。
EGCG(纯度99.5%)购自浙江乾盛康药业有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(批号:20101109)系南京建成生物工程研究所产品;β-半乳糖苷酶活性检测试剂盒为碧云天生物试剂公司产品,抗鼠β-actin 抗体,抗鼠NF-κB-P65,抗鼠IκBα(Y42)抗体以及辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG 购自巴傲德生物科技公司。
模型组小鼠和对照组小鼠每10 d 进行体重监测;并在第9 w 对小鼠进行记忆能力训练和检测。在设定的迷宫中对两组小鼠进行为期5 d,每天10次的训练,记录50 次中的正确次数。记忆能力测试主要根据逃避到安全区的时间赋分,直接逃避到安全区给予2 分,受击后再进行逃避给予1 分,否则为0 分,以总分作为记忆成绩[9]。
采用断尾取血的方法收集各组小鼠外周血,3500 rpm 离心10 min,收集血清。利用SOD 活性检测试剂盒,在酶标仪的589 nm 波长下检测后进行数据处理。
当EGCG 处理模型组小鼠4 w 时,利用10%水合氯醛腹腔注射分别麻醉年轻组、衰老组以及EGCG 处理组小鼠各1 只,断头取出脑组织后立即投入4%多聚甲醛固定液中固定24 h,进行冰冻切片,利用SA-β-Gal 染色试剂盒对病理切片进行洗脱、固定、染色、脱色、封片处理,最后在高倍显微镜下观察海马区神经元染色比率。
EGCG 处理模型组小鼠5 w 后,分别取年轻组(n=4)、衰老组(n=4)以及EGCG 处理组(n=8)小鼠脑组织50 mg 于液氮研磨后置于EP 管中,加入蛋白裂解液200 μL 于4 ℃裂解30 min,同时每10 min 震荡一次,每次30 s,4 ℃,12000 rpm 离心10 min,取上清,考马斯亮蓝G250 对蛋白进行定量后进行Western blotting 分析,以β-actin 为内参照检测NF-κB-P65 和IκBα(Y42)蛋白表达变化情况。
研究结果表明,与对照组相比,模型组小鼠30 d后体重增长缓慢(表1,图1),且毛发较年轻组黄,进食量减少。与对照组相比,模型组小鼠正确逃避反应能力迟缓,正确次数明显减少,记忆评分较低,均具有显著性差异;模型组小鼠外周血中,SOD 活性也显著性降低(表2)。
表1 D-半乳糖诱导小鼠衰老过程中的体重变化Table 1 The changes of weight for the mice treated by d-gal compared to control mice
图1 D-半乳糖诱导小鼠衰老过程中的体重变化趋势图Fig.1 The tendency of weight changes of mice during d-gal treatment
当EGCG 处理衰老模型小鼠4 w 时,进行小鼠外周血SOD 活性检测和小鼠大脑病理切片SA-β-Gal 染色分析。结果发现:与衰老组相比,EGCG 处理组SOD 活性明显升高,达到115.24 ±11.06(图2)。小鼠大脑病理切片进行SA-β-Gal 染色分析检测发现:衰老组小鼠海马区细胞在一个视野下有20%~30%细胞膜被蓝染,而年轻组小鼠海马区细胞只有5%左右被蓝染,EGCG 处理组,在多个视野下,只能观察有5%细胞膜周围被蓝染现象,与年轻组小鼠海马区染色结果相似(图3)。因此,EGCG处理后海马区衰老细胞明显减少。
表2 模型组与对照组小鼠的记忆力及外周血SOD 活性比较Table 2 Comparison of memory capability and SOD activity in mice serum between model group and control group
图2 年轻组、衰老组及EGCG 组小鼠外周血SOD 活性分析Fig.2 The changes of SOD activity for young group,aging group and EGCG treatment group
图3 小鼠海马区神经元病理切片的SA-β-Gal 染色分析(×400)Fig.3 SA-β-Gal staining of mice hippocampal neurons for young group,aging group and EGCG treatment group
小鼠脑组织NF-κB-P65 和IκBα(Y42)蛋白表达情况如图4 所示。年轻组小鼠脑组织IκBα 蛋白表达较高,而NF-κB 蛋白表达较低,当利用D-半乳糖诱导衰老后,IκBα 蛋白表达受到明显抑制(P<0.05);而NF-κB 蛋白表达被激活,与年轻组相比,NF-κB 表达升高了2.03 倍(P<0.05)。1 mg/(kg·d)的EGCG 处理衰老模型组小鼠5 w 后,与衰老组相比,IκBα 蛋白表达呈上调趋势,NF-κB 蛋白表达被抑制。所以,EGCG 能阻滞衰老所引起的NFκB 蛋白的激活。
图5 小鼠脑组织NF-κB 和IκBα 蛋白表达分析Fig.5 Protein expression changes of IκB-α and NF-κB of mice brain tissue for young group,aging group and EGCG treatment group
细胞衰老(cellular aging)是一个极其复杂的生物学过程,主要指正常细胞在不能分裂后所进入的状态。此时细胞仍然是存活的,但细胞的基因和蛋白的表达谱发生了很大改变,从而出现细胞形态、结构以及细胞内酶活性改变等一系列现象。目前,关于人体衰老机制研究主要包括两大学说,即氧化损伤学说和端粒学说。其中氧化损伤学说及作用机制已经在不同研究中得到证明。过量氧自由基可以导致各种大分子如DNA,蛋白质的氧化损伤,从而造成基因表达紊乱和蛋白质的损伤,引起机体衰老[10]。D-半乳糖已被证明,在不同动物中均可以通过增加氧化强度,降低抗氧化酶的活性和线粒体的作用来加速衰老。所以,D-半乳糖被广泛用于衰老模型的构建。本实验中,连续9 w 每天于小鼠颈部皮下注射约250 μg 的D-半乳糖,经小鼠行为学检测,外周血SOD 活性及脑组织海马区SA-β-Gal 染色检测发现D-半乳糖能显著引起小鼠氧化损伤,从而成功建立小鼠衰老模型。
有研究表明,EGCG 处理人源性肝癌细胞系HCCLM6 后,能引起广泛细胞凋亡的发生[11]。所以,EGCG 与炎症发生和细胞凋亡存在密切关系。研究人员一直认为,炎症不只是衰老发生的一个旁观者,其很可能加快了衰老的进程,但具体分子机制报道较少。2013 年,美国一研究小组揭示:年轻小鼠下丘脑中NF-κB 几乎不具有活性,随着衰老的进程,下丘脑中的NF-κB 被逐渐激活[8]。所以,下丘脑中的炎症有可能是整个身体衰老的根源,其与NF-κB 激活程度相关。本研究发现,EGCG 处理后,抑制了小鼠脑组织NF-κB 的表达,而IκBα 蛋白表达有上调趋势。所以,EGCG 很可能通过阻碍NF-κB 的表达而延迟衰老进程。核转录因子NF-κB在细胞活动过程中是一个重要的调节因子,参与免疫反应,细胞增殖,分化和凋亡等相关400 多个基因转录的调控[4,12]。NF-κB 的激活涉及IκB 的磷酸化,而后者有赖于IKK(IκB 激酶)的调控。在哺乳动物中,IκB 蛋白是NF-κB 主要抑制剂,主要包括IκBα、IκBβ 和IκBγ 三种因子[13]。所以,EGCG 可能通过刺激IκBα 的表达而抑制NF-κB 的活化,进而延缓了衰老进程。但此推论还需要通过磷酸化IκBα 蛋白表达以及细胞核内磷酸化NF-κB-P65 的表达变化进一步得到验证。因此,本研究发现EGCG 具有明显抗衰老作用,其机制可能通过抑制NF-κB 的表达而阻碍了细胞衰老的进程。该研究结果为EGCG 相关的抗衰老保健品开发提供了一个新的方向。
1 Lan Z,Liu J,Chen L,et al.Danggui-Shaoyao-San amelio-rates cognition deficits and attenuates oxidative stress-related neuronal apoptosis in d-galactose-induced senescent mice.J Ethnopharmacol,2012,141:386-395.
2 Someya S,Prolla TA.Mitochondrial oxidative damage and apoptosis in age-related hearing loss.Mech Ageing Dev,2010,131:480-486.
3 Lopez-Burillo S,Tan DX,Mayo JC,et al.Melatonin,xanthurenic acid,resveratrol,EGCG,vitamin C and alpha-lipoic acid differentially reduce oxidative DNA damage induced by Fenton reagents:a study of their individual and synergistic actions.J Pineal Res,2003,34:269-277.
4 Karin M,Ben Neriah Y.Phosphorylation meets ubiquitination:the control of NF-κB activity.Annu Rev Immunol,2000,18:621-663.
5 Li Q,Verma IM.NF-κB regulation in the immune system.Nat Rev Immunol,2002,2:725-734.
6 Singh M,Singh R,Bhui K,et al.Tea polyphenols induce apoptosis through mitochondrial pathway and by inhibiting nuclear factor-kappaB and Akt activation in human cervical cancer cells.Oncol Res,2011,19:245-57.
7 Sriram N,Kalayarasan S,Sudhandiran G.Epigallocatechin-3-gallate augments antioxidant activities and inhibits inflammation during bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis through Nrf2-Keap1 signaling.Pulm Pharmacol Ther,2009b,22:221-236.
8 Zhang G,Li J,Purkayastha S,et al.Hypothalamic programming of systemic ageing involving IKK-beta,NF-kappaB and GnRH.Nature,2013a,497:211-216.
9 Sun MM(孙茂民),Liu J (刘珺),Chen EQ (陈尔齐),et al.Expression of P21WAF-1 of neuron in second-acute brain aging models.Lab Animal Comparative Med (实验动物与比较医学),2006,26:223-226.
10 Meng Q,Velalar CN,Ruan R,et al.Regulating the age-related oxidative damage,mitochondrial integrity,and antioxidative enzyme activity in Fischer 344 rats by supplementation of the antioxidant epigallocatechin-3-gallate.Rejuvenation Res,2008a,11:649-660.
11 Zhang Y,Owusu L,Duan W,et al.Anti-metastatic and differential effects on protein expression of epigallocatechin-3-gallate in HCCLM6 hepatocellular carcinoma cells.Int J Mol Med,2013,32:959-964.
12 Wang CY,Mayo MW,Baldwin AS,et al.TNF and cancer therapy-induced apoptosis:potentiation by inhibition of NFkappaB.Science,1996,274:784-787.
13 Tsuchiya Y,Asano T,Nakayama K.Nuclear IKKbeta is an adaptor protein for IkappaBalpha ubiquitination and degradation in UV-induced NF-kappa B activation.Mol Cell,2010,39:570-582.