板栗花纯露的抗氧化活性研究

邵明辉，王雪青*，宋文军，赵国强，付庆伟

1天津市食品与生物技术重点实验室 天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134;2唐山迁西县板栗产业研究发展中心，唐山 064300

紫外线辐射能引起皮肤变黑、红斑和光敏等急性反应或导致皮肤干燥、起皱失去弹性和色素沉着等慢性反应，甚至有可能诱发皮肤癌［1］，由紫外线辐射引起的皮肤氧化是导致皮肤损伤、老化的重要原因［2，3］。因此，在阳光充足的夏季，护肤产品的抗氧化和防紫外线功能显得越来越重要。目前在医疗、食品和化妆品领域广泛应用的多为化学合成抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)等。研究发现，长期使用合成抗氧化剂，对生物体有潜在的毒副作用［4］。因此，开发以天然植物成分为主的抗氧化产品是近年来的研究热点。

板栗花为壳斗科(Fagceae)栗属植物栗(Castanea mollissima Blume)的雄性花序，香气怡人、柔和、开阔，形状为圆柱状葇荑花序［5］。近年来，伴随着板栗种植面积的不断增加，其副产物板栗花的产量也十分可观，但大多被当作废物丢弃或燃料燃烧，造成资源的极大浪费。据报道，板栗花中含有丰富的活性物质，不仅具有显著的抗氧化作用［6］，而且还有比较明显的驱蚊效果［7］。目前，针对板栗花抗氧化性研究主要集中在黄酮类化合物上，其挥发性成分的抗氧化性研究甚少。因此，本研究选取提取板栗花精油过程中产生的副产物纯露为研究对象，研究其抗氧化性并与夏季常用的花露水产品作对比，为板栗花的天然抗氧化性研究提供理论依据，为开发抗氧化新型花露水提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

板栗花纯露，由河北省唐山市迁西县板栗研究发展中心提供(在蒸汽压力为0.04 MPa，液固比为6，蒸馏2.5 h 条件下制得)。板栗花纯露通过复蒸的方式经油水分离器得挥发油，约占板栗花纯露的0.0621%，所获得的板栗花精油为浅黄色油状液体，具有浓郁的板栗花的特殊香气。挥发油经GC-MS分析，鉴定出19 种化合物，占挥发油总量的98.21%，其中主要成分为α-甲基苯甲醇(11.88%)、芳樟醇(9.46%)、壬醛(11.73%)、松油醇(5.42%)、棕榈酸(10.69%)和9，12-十八碳二烯酸(8.01%)等;隆力奇驱蚊花露水，其主要成分为乙醇、二乙基甲苯甲酰胺(5%)、二苯酮-4、三乙醇胺、蛇胆提取物、CI42090 等;六神驱蚊花露水，其主要成分为乙醇、丁基乙酰氨基丙酸乙酯(4.5%)、薄荷醇、EDTA 二钠、蛇胆提取物、CI42090 等，均购于当地超市;DPPH，Sigma 公司;实验所用其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

Alpha-1500 型紫外可见分光光度计，上海谱元仪器有限公司;722N 型可见分光光度计，北京晶弘精密仪器有限公司;ZK-82A 型真空干燥箱，天津远方实验仪器厂;KQ2200B 型超声波清洗机，南京市超声仪器有限公司;Perkin Elmer UV/VIS，Spectrometer Lambda 25。

1.3 实验方法

1.3.1 板栗花纯露清除DPPH 自由基能力的测定［8，9］

将板栗花纯露稀释成不同浓度的溶液，同样将六神、隆力奇花露水和Vc 稀释成相同浓度作为样品溶液。分别向一系列10 mL 比色管中加入3.5 mL 用乙醇稀释浓度为1.0 ×10-4mol/L 的DPPH 溶液和0.5 mL 样品液，摇匀，避光反应30 min，以乙醇作为参比，测定517 nm 下的吸光度A，同样方法测定3.5 mL 无水乙醇和0.5 mL 样品液混合后在517 nm 下的吸光度A0，再测定3.5 mL DPPH 溶液和0.5 mL 无水乙醇混合后在517 nm 下的吸光度A1，平行测定三次，取平均值，并按以下公式计算不同浓度的样品液对DPPH 自由基的清除率。利用不同浓度样品溶液的清除率绘制曲线图，由曲线拟合回归方程计算DPPH 自由基清除率为50%时所需板栗花纯露浓度，记为IC50，以IC50值表示板栗花纯露清除DPPH 自由基能力。

1.3.2 板栗花纯露还原能力的测定［10］

分别配制不同浓度的板栗花纯露，同样方法配制相同浓度的Vc 溶液、隆力奇和六神样品液作为对阳性照组。分别加入0.2 mol/L 的磷酸缓冲液2 mL，质量分数为1%的铁氰化钾［K3Fe(CN)6］溶液2 mL，混合均匀，50 ℃水浴下保温20 min，再加入质量分数为10%的三氯乙酸(TCA)溶液2 mL，震荡混匀后离心。取离心后的上清液2 mL，加入2 mL 去离子水和0.4 mL 质量分数为0.1% 的氯化铁(FeC13)溶液，震荡混匀后在50 ℃水浴下保温10 min，体系溶液由黄色变为蓝色，在700 nm 下测定吸光度，进行比色。以去离子水代替样品作为空白对照。平行测定三次，取平均值。

1.3.3 板栗花纯露清除羟基自由基能力的测定［11］

以板栗花纯露作为样品液，配制好的Vc 溶液、隆力奇和六神样品液作为对阳性对照组。在一系列10 mL 比色管中分别加入0.3 mL 浓度为0.4 mmol/L 的结晶紫溶液、1.2 mL 浓度为1.0 mmol/L 的硫酸亚铁(FeSO4)溶液和0.6 mL 浓度为2.0 mmol/L 过氧化氢(H2O2)溶液，用pH=4.0 的磷酸柠檬酸缓冲溶液将上述溶液定容至10 mL，摇匀后静置30 min，在580 nm 处，测其吸光度Ab，同时测定以上体系加过氧化氢之前，分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的样品液后体系在580 nm 处的吸光度Ax，测定不加过氧化氢前体系在580 nm 处的吸光度A0。平行测定三次，取平均值。按以下公式计算清除率。

1.3.4 板栗花纯露对亚硝酸盐清除率的测定［12］

取已知浓度的板栗花纯露2 mL 于25 mL 容量瓶中，加入0.005 mg/mL 的亚硝酸钠(NaNO2)标准溶液3 mL，加入pH=3.0 的磷酸柠檬酸缓冲溶液5 mL，37 ℃下反应30 min，立即加入2 mL 质量浓度为0.4%的对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5 min后，加入1 mL 质量浓度为0.2%的盐酸萘已二胺溶液，加蒸馏水至刻度，混匀，静置15 min，以5 mL 样品液为空白组，在544 nm 处，测定吸光度为A，测定NaNO2标准溶液的吸光度为A0，按以下公式计算样品液对NO-2 的清除率。

1.4 数据处理与分析

2 结果与讨论

2.1 板栗花纯露清除DPPH 自由基的能力

不同浓度的板栗花纯露、六神、隆力奇和Vc 样品液清除DPPH 自由基能力见图1。由图1 可以看出，样品液对DPPH 自由基的清除率随浓度的增加而增大，当样品液浓度达到0.5 mg/mL 时，清除率趋于稳定。此时板栗花纯露的清除率为80.64%;六神样品液的清除率为70.21%;隆力奇样品液的清除率为60.14%;Vc 溶液的清除率为90.04%。

许多学者对天然产物中的黄酮类［13，14］和多酚类［15］化合物清除DPPH 自由基能力进行了研究，而鲜见对其他类物质的研究报道，特别是植物纯露清除DPPH 自由基方面的研究仅见2014 年孟慧报道［16］，她在研究四种芳香植物纯露体外抗氧化活性中发现，当浓度为0.376 mg/mL 时，薰衣草纯露、肉豆蔻纯露、沉香纯露和降香纯露对DPPH 自由基的清除率分别为58.217%、52.098%、9.016% 和8.525%。由DPPH 自由基清除率/样品液浓度曲线的拟合回归方程可知，当板栗花纯露的浓度为0.376mg/mL时，DPPH自由基的清除率为66.325%，而且当板栗花纯露浓度为0.5 mg/mL 时，与六神、隆力奇样品液相比，DPPH 自由基的清除率分别提高了15%(P＜0.01)和34%(P＜0.01)，由此可见，板栗花纯露较报道的其他植物纯露抗氧化性更强，显示出板栗花纯露具有较强的清除DPPH 自由基能力。

图1 板栗花纯露对DPPH 自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging ability of the hydrosol from chestnut flower

由板栗花纯露、六神、隆力奇和Vc 样品液的拟合线性回归方程计算各个样品液清除DPPH 自由基的IC50值分别为0.25、0.32、0.38 mg/mL 和0.21 mg/mL。板栗花纯露清除DPPH 自由基的IC50为0.25 mg/mL，明显优于两种市售花露水但略小于Vc(P＜0.01)。实验各组样品清除DPPH 自由基能力大小顺序依次为:Vc ＞板栗花纯露＞六神样品液＞隆力奇样品液。

2.2 板栗花纯露的还原能力

不同浓度的板栗花纯露、六神、隆力奇和Vc 样品液的还原能力见图2。由图2 可知，板栗花纯露的吸光度随浓度的增大而增加，当浓度为1.5 mg/mL 时，吸光度达到最大值为0.88，之后略有下降，即板栗花纯露的还原能力随浓度也是先增加后降低，浓度为1.5 mg/mL 时，还原能力最强。同样，隆力奇和六神样品液的吸光度随浓度呈现相同的趋势，但没有板栗花纯露还原力那样稳定，同等浓度下，板栗花纯露的还原能力相对较大，抗氧化能力相对较强。实验结果反映出板栗花纯露的还原能力虽然不及同浓度的Vc 但却远大于六神、隆力奇样品液(P＜0.01)，这可能是板栗花纯露中存在某些具有抗氧化活性的多酚类物质，充当了供电子的还原剂，从而表现出较强的还原能力［17］。

图2 板栗花纯露的还原能力Fig.2 Reducing power of the hydrosol from chestnut flower

2.3 板栗花纯露清除羟基自由基的能力

不同浓度的板栗花纯露、六神、隆力奇和Vc 样品液清除羟基自由基能力见图3。由图3 可知，样品液对羟基自由基的清除率随浓度的增大而增加，当浓度为0.1 mg/mL 时，清除率达到最大值，之后保持稳定。此时，板栗花纯露的清除率为74.03%，六神样品液的清除率为61.24%，隆力奇样品液的清除率为64.84%，Vc 的清除率为29.98%。相比，板栗花纯露对羟基自由基的清除率最大且分别提高了21%(P＜0.01)、14%(P＜0.01)和147(P＜0.01)。

生物体在氧化呼吸过程中，伴随着能量的产生，会形成一定量的活性氧(ROS)，然而生物在进化过程中，自身拥有一套完整的抗氧化防御体系，能及时清除产生的ROS，从而保证细胞正常的能量和物质代谢的顺利进行［18］。当细胞受到紫外线等射线的辐射胁迫时，能诱导产生超氧阴离子(O-·2)、过氧化氢(H2O2)和羟基自由基(OH·)等活性氧［19］，使细胞内ROS 不断积累，当超过自身清除能力时，过多的ROS 积累则导致迸发现象的发生。同时ROS 能氧化细胞膜中有多个不饱和双键的脂类物质，形成丙二醛(MDA);MDA 与蛋白质、核酸或脂类发生交联，破坏细胞结构与功能，造成细胞的氧化损伤［20］。在体外实验体系中，环境中的Fe3+和Fe2+能催化过氧化氢和超氧阴离子反应生成羟基自由基，羟基自由基是活性氧中反应能力最强的一种，它几乎可以和细胞内的一切有机物反应，它能杀死红细胞，降解细胞膜、DNA 和多糖类化合物，引起组织细胞病变，导致疾病发生和加速机体衰老［21］。本实验利用此原理，测定板栗花纯露清除羟基自由基能力，以反映板栗花纯露的抗氧化性能。实验结果证实板栗花纯露具有较强的抗氧化性，可作为潜在的防晒产品。

许多天然抗氧化剂常显示出强有力的清除羟基自由基能力，其原因可能正是由于天然产物中含有化学结构复杂且浓度很低的多种物质，如板栗花纯露中包含精油的一些组分，如芳樟醇、香叶醇等。混合的抗氧化剂较单一的合成抗氧化剂有更多的还原基团，具有提供氢质子的能力，可使具有高度氧化性的自由基还原，从而终止自由基连锁反应，起到清除或抑制自由基反应的目的。李荣［22］等在研究肉豆蔻精油抗氧化性能时，发现天然抗氧化剂的羟基自由基清除能力强于2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)和没食子酸丙酯(PG)等合成抗氧化剂。这一结果与我们的一致。

2.4 板栗花纯露清除亚硝酸盐的能力

图3 板栗花纯露对羟基自由基的清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging ability of the hydrosol from chestnut flower

不同浓度的板栗花纯露、六神、隆力奇和Vc 样品液清除亚硝酸盐的能力见图4。由图4 可见，板栗花纯露对亚硝酸盐清除率随着浓度的增大而增加，当浓度为4 mg/mL 时，清除率达到最大值为84.77%，之后略有降低。

人摄食亚硝酸盐含量高的食物后，患癌症的风险会显著增加，这是由于胃中的食物处在酸性条件下，亚硝酸盐可与食物中的仲胺、叔胺和酰胺等反应生成强致癌物亚硝胺，该物质具有较强的致癌作用［23］。板栗花纯露对亚硝酸盐的清除能力明显优于其他三种样品液，这说明了板栗花纯露不仅具有开发成为新型防晒花露水的潜力，同时也具备作为一种天然抗氧化剂应用于食品行业的可能性。

图4 板栗花纯露对亚硝酸盐的清除能力Fig.4 Nitrite scavenging ability of the hydrosol from chestnut flower

3 结论

板栗花纯露在一定浓度范围内具有良好的抗氧化活性，当板栗花纯露浓度为0.5 mg/mL 时，清除DPPH 自由基能力最强，清除率为80.64%，IC50为0.25 mg/mL;浓度为1.5 mg/mL 时，还原能力最强;浓度为0.1 mg/mL 时，清除羟基自由基能力最强，清除率为74.03%;浓度为4 mg/mL 时，清除亚硝酸盐能力最强，清除率为84.77%。在实验各处理组相同浓度下，板栗花纯露清除羟基自由基和亚硝酸盐能力最好;而清除DPPH 自由基能力和还原能力弱于Vc。板栗花纯露抗氧化机理复杂，还有待进一步地讨论和研究。

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