对苯酚氯仿法和盐析法提取DNA的归纳

姜海霞

提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同理化性质的生物大分子。对于DNA的提取而言，就是要利用DNA与RNA、多糖、蛋白质和脂质等在物化性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。苯酚氯仿法和盐析法是高中生物提取DNA的两种常规方法，下面对苯酚氯仿法和盐析法提取DNA的原理、注意事项、常见问题与对策等进行了归纳分析。

1.两种提取DNA的原理理解

1.1苯酚氯仿法原理

苯酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，可使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。SDS能将细胞膜裂解，在EDTA、蛋白酶K的存在下消化蛋白质分子，使核蛋白变性降解，从而使DNA从核蛋白中游离出来。蛋白质表面带有亲水基团，容易进行水合作用，使蛋白质分子能进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。

1.2盐析法原理

DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl的浓度变化而改变：在NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？这是因为用高浓度的盐溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；而用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。

2.两种提取DNA的注意事项

两种提取DNA的大体方法均是：材料准备→破碎细胞，释放内容物→核酸分离、纯化→沉淀或吸附核酸并去除杂质→核酸溶解在适量缓冲液或水中。其中注意的事项归纳如下：

材料准备：最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融；提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）；组织培养的细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解；含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集。

细胞裂解：针对不同材料，选择适当的裂解方式：（1）对植物材料采用液氮研磨；（2）对动物组织采用匀浆或液氮研磨；（3）组织培养细胞时加人蛋白酶K；（4）在细菌中加入溶菌酶破壁；（5）在酵母菌中加入破壁酶。

核酸分离、纯化：采用苯酚氯仿抽提时应充分混匀，但动作要轻柔，离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法。（1）蛋白质的去除：①酚/氯仿抽提；②使用SDS；③高盐洗涤；④蛋白酶处理。（2）多糖的去除：①高盐法，高盐可溶解多糖；②用多糖水解酶将多糖降解；③在提取缓冲液中加一定量的氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。（3）多酚的去除：①在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、半胱氨酸等；②加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEGf聚乙二醇），它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合。（4）盐离子的去除：70%的乙醇洗涤。

核酸沉淀、溶解：当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分。沉淀时加入1/10体积的NaAc，有利于充分沉淀。沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等。若长期储存DNA建议使用TE缓冲液溶解，TE中的EDTA能螯和Mg²⁺或Mn²⁺离子，抑制DNase。

3.DNA提取常见问题与对策

（1）DNA样品不纯的原因及对策：

①DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质，可采用重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质。

②DNA在溶解前，有酒精残留，可采用重新沉淀DNA，让酒精充分挥发。

③DNA中残留有金属离子，可采用增加70%乙醇洗涤的次数（2～3次）。

（2）DNA降解的原因及对策：

①材料不新鲜或反复冻融，可采用尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融。

②未很好抑制内源核酸酶的活性，可采用液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液；在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量。

③提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。

④外源核酸酶污染，可采用所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。

⑤反复冻融，可采用将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。

（3）DNA提取量少的原因及对策：

①实验材料不佳或量少，尽量选用新鲜和幼嫩的材料。

②破壁或裂解不充分，动植物要匀浆研磨充分；酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁；高温裂解时，时间适当延长。

③沉淀不完全，可采用低温沉淀，延长沉淀时间；加辅助物，促进沉淀。

④洗涤时DNA丢失，洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒。