肝素/壳聚糖微胶囊的制备及其抗凝血性能

梁 艳， 宋家鸿， 陈荆晓， 陈敬华

（江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

肝素/壳聚糖微胶囊的制备及其抗凝血性能

梁 艳， 宋家鸿， 陈荆晓， 陈敬华*

（江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

采用层层自组装（LbL）技术制备了肝素/壳聚糖（HEP/CHI）5微胶囊，并研究了其抗凝血性能、胃肠道稳定性和毒副作用等。结果表明：该微胶囊具有球形结构；在pH 5.0、7.4中肝素能够缓慢可控地释放；在pH 5.0、7.4以及模拟胃液、肠液条件下具有稳定性；APTT法和全凝固实验验证了它在体外具有良好的抗凝血效果；并且对内皮细胞无细胞毒性。因此，该微胶囊有望作为口服剂型，用于临床肝素给药。

微胶囊；肝素；抗凝血；层层自组装；口服剂型

肝素（Heparin，HEP）是一种临床上广泛使用的抗凝血药物，一般采用静脉或皮下注射方式给药[1-2]。这一给药方式对于有血凝块危险的病人而言，具有可能引发感染、病患适应度低和成本高昂等问题[1]。口服肝素是近年研究的热点，但肝素在胃肠道中存在易被降解失活[3-4]，难以透过黏膜吸收[5]等问题。层层自组装（LbL）微胶囊是一种新型的多功能载体，其具有改善药物稳定性、控制药物释放以及可功能化修饰等优点[6-7]。利用具有不同理化性质的生物活性材料制备微胶囊，可有效改善药物的稳定性[6]和生物利用度[8]。壳聚糖（Chitosan，CHI）是一种天然的阳离子聚合物，具有良好的生物相容性、低毒性、生物可降解性、强生物粘附能力以及促进药物跨上皮黏膜传递等优点[8-10]。将它作为载体，可以促进药物在胃肠道的渗透吸收[9，11]。本文作者通过LbL法制备（HEP/CHI）5微胶囊，并对其抗凝血性能、胃肠道稳定性和毒副作用等性质进行了研究。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂与仪器

肝素钠（分子量15 kDa），购于生物工程（上海）有限公司；壳聚糖盐酸盐（分子量50 kDa，脱乙酰度91%），购自浙江澳兴生物科技有限公司；活化部分凝血活酶时间（APTT）测定试剂盒（鞣花酸），购自上海太阳生物技术有限公司；人血浆，由无锡市第四人民医院提供；兔血，取自成年新西兰兔。

S-4800型扫描电子显微镜 （SEM），H-7650型透射电子显微镜（TEM），日本日立有限公司制造；C1-si激光共聚焦电子显微镜（CLSM），日本尼康映像仪器有限公司制造；Zetasizer Nano ZS纳米粒度仪，英国马尔文仪器有限公司制造；DMIL LED倒置荧光显微镜，德国徕卡仪器有限公司制造；Fluoroskan Ascent FL荧光和化学发光检测仪，Multiskan GO通用微型孔板分光光度计，赛默飞世尔科技有限公司制造。

1.2 （HEP/CHI）5微胶囊的制备

将CHI 1 mg溶于0.33 mol/L K2CO3溶液5 mL中，将等量CaCl2快速加入其中，制备CaCO3球形模板（Template）[12]。利用层层自组装（LbL）技术[13]制备（HEP/CHI）5-Template微胶囊。将CaCO3微球150 mg浸没到2 g/L肝素溶液1 mL中，37℃孵育15 min至静电吸附达到平衡，用去离子水小心洗净微球，之后再浸没到2 g/L壳聚糖溶液1 mL中，继续37℃下孵育15 min。重复上述操作，至（HEP/CHI）5微胶囊制备完成。加入0.4 mol/mL pH 7.4乙二胺四乙酸二钠 （EDTA）溶液4 mL，除去CaCO3模块，得到（HEP/CHI）5微胶囊。为进行荧光观测，用异硫氰酸荧光素（FITC）对HEP进行标记。

1.3 LbL自组装条件优化

首先对微球加入聚电解质溶液中的吸附时间进行优化。操作步骤如1.2中所述，孵育时间为15 min或2 h。每吸附一次聚电解质，取样用去离子水洗净后再分散于水中，此时微球浑浊液pH为9.4，测定微球表面的ζ-电势。随后对LbL自组装过程中聚电解质的浓度进行优化。将CaCO3微球150 mg，分别加入不同浓度的等体积肝素或者壳聚糖溶液中，37℃孵育15 min，收集沉淀，再分散到pH 7.4或pH 9.4的缓冲液中，分别测量微球表面的ζ-电势。检测壳聚糖浓度影响时，CaCO3微球将先吸附一层肝素后，再吸附不同浓度的壳聚糖。误差棒由3组平行样品计算标准偏差所得。

1.4 LbL自组装过程中微球表面ζ-电势和粒径的变化趋势

将CaCO3微球150 mg使用层层自组装技术（LbL）装配微胶囊壁，操作过程如1.2所述。将微球再分散到pH 7.4缓冲液后，使用Nano ZS纳米粒度仪测量ζ-电势和粒径。误差棒由3组平行样品计算标准偏差所得。

1.5 CaCO3微球与（HEP/CHI）5微胶囊形貌观察

将少量CaCO3微球滴至铝箔片上，干燥后喷金处理，用扫描电子显微镜（SEM）观察CaCO3微球的形貌。将（HEP/CHI）5微胶囊用0.2 g/mL磷钨酸钠溶液染色，使用透射电子显微镜（TEM）观察其干态下形貌。将（HEP/CHI）5微胶囊用激光共聚焦电子显微镜 （CLSM）观察其在水溶液中的形貌，微胶囊中HEP用FITC标记。

1.6 抗凝血活性分析

将0.1、0.5、2 g/L（HEP/CHI）5微胶囊、0.25 g/L肝素、生理盐水各1 mL，分别加入兔血2 mL中，于0 h和1 h后拍摄照片。肝素作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照。

利用APTT法检测 （HEP/CHI）5微胶囊的抗凝血时间。将0.445 g/L（HEP/CHI）5微胶囊于37℃中孵育，待HEP释放1 h或24 h后，分别取样品15 μL和人血浆100 μL混合，按照活化部分凝血活酶时间（APTT）测定试剂盒说明书操作，记录凝血时间。生理盐水作为对照组。

随后检测微胶囊质量浓度对凝血时间的影响。将梯度质量浓度（HEP/CHI）5微胶囊置于37℃中孵育，待HEP释放24 h后，APTT法检测溶液的抗凝血时间，肝素作为对照组。

1.7细胞毒性试验

将内皮细胞（ECs）在DMEM培养基中培养，培养基加入了质量分数10%胎牛血清FBS和质量分数1%双抗（青霉素与链霉素，10 000 U/mL），37℃，质量分数5%CO2湿润环境培养。MTT法测试（HEP/CHI）5微胶囊对ECs的细胞毒性。将细胞用胰酶消化后加入96孔细胞板中，每孔8 000个细胞。每孔加入含质量分数10%小牛血清的DMEM培养基100 μL，培养24 h，弃去培养基。再加入梯度质量浓度的（HEP/CHI）5微胶囊100 μL，培养24 h后，PBS冲洗，每孔加入MTT（0.5 mg/mL，PBS）110 μL，继续培养4 h。弃去孔中液体，加入二甲亚砜100 μL，充分溶解生成的甲瓒，使用通用微型孔板分光光度计测量570 nm处的UV吸收OD值，通过公式（1）计算细胞存活率。肝素作为对照组。

式（1）中：ODyp为加入药物时的UV吸收值，ODdz为不加药物时的UV吸收值，RC为细胞存活率。

1.8 稳定性分析

利用肝素的释放行为检测 （HEP/CHI）5微胶囊在pH 5.0或7.4条件下的稳定性。将（HEP/CHI）5微胶囊约75 mg分散于1 mL水中，两等分，分别加入透析袋（MWCO 25 kDa）中，之后将透析袋置于pH 5.0或7.4 PBS溶液6 mL中进行透析。间隔一定时间取样，样品在激发波长480 nm、发射波长520 nm处测定FITC的荧光强度，并由公式（2）计算HEP的累积释放率。每个实验都进行3组平行实验，取平均值。

式（2）中：Mt为t时刻HEP的累积释放量，Mo为微胶囊中HEP总量，RS为HEP累计释放率。

为了测量 （HEP/CHI）5微胶囊中HEP的总量，将微胶囊12.5 mg加入6 mol/L HCl溶液1 mL中，测量FITC荧光强度，通过标准曲线计算HEP总量，激发波长为485 nm，发射波长为520 nm。

随后检测（HEP/CHI）5微胶囊在模拟胃液、肠液条件下的稳定性。将（HEP/CHI）5微胶囊25 mg分别加入到模拟胃液1 mL（胃蛋白酶活力>1 200 U/mL，pH 2）或模拟肠液1 mL（胰酶，pH 6.8）中，于37℃孵育，间隔一定时间取样，样品置于沸水中3 min使酶失活后，使用倒置荧光显微镜拍摄图像。PBS作为对照组。

2 结果与讨论

2.1 LbL自组装条件优化

2.1.1 聚电解质沉积时间选择在LbL自组装过程中，微球吸附聚电解质的时间长短，可能影响聚电解质吸附到微球表面的量。如图1（a）所示，不同的吸附时间15 min和2 h导致的ζ-电势变化差异并不明显，这说明15 min的时间长度已经足够聚电解质在微球表面吸附达到平衡状态，延长时间并不能使更多的聚电解质沉积到微球表面。相反，2 h反而会使实验误差增大，稳定性下降。因此15 min更适合作为聚电解质的沉积时间。

2.1.2 聚电解质浓度对微胶囊制备的影响已有研究文献[14]报道，聚电解质浓度的强弱也是影响LbL自组装的因素之一，因此对其进行优化。从图1（b）可知，随着壳聚糖质量浓度的增大，微球表面ζ-电势呈现明显上升趋势，质量浓度低于0.5 g/L时上升趋势迅猛，2 g/L后才逐渐平稳。这一方面表明低质量浓度壳聚糖不足以使微球表面静电吸附达到平衡。另一方面质量浓度过大（>3 g/L）时，壳聚糖溶液黏度将大幅上升，降低它的分子扩散速度，影响自组装效率。因此，2 g/L壳聚糖最为适合。另外，由图1（c）可知，随着肝素质量浓度的增大微球表面ζ-电势呈现明显下降趋势，低质量浓度时ζ-电势迅速下降，2 g/L后ζ-电势几乎不再变化。但随着肝素质量浓度继续升高，误差有所增大。所以选取2 g/L肝素为宜。

另外，在图1（a）中所有ζ-电势值均处于负值，这并不符合微胶囊LbL组装的原理。这种现象可能是由于测量时微球悬液的pH值所致。因此随后检测了pH 9.4（CaCO3微球浑浊液pH）和pH 7.4（血液pH）条件对ζ-电势的影响。如图1（b）（c）所示，pH 7.4时ζ-电势数值范围与pH 9.4时几乎均相差20 mV左右，但随质量浓度变化的趋势基本相同。这表明图1（a）中ζ-电势均为负值的现象主要是由于检测时pH为9.4所导致，而非为微胶囊制备工艺本身的原因。将检测时pH调节为7.4后，如图1（d）所示，ζ-电势将随聚电解质膜层数的增加，呈现明显的正负值交替现象。这表明带有相反电荷的肝素和壳聚糖交替吸附到CaCO3模板的表面，完成了LbL自组装的过程。

图1 LbL自组装过程Fig.1 During LbL self-assembly （a） impactof polyelectrolyte coating time， impact of（b）heparin or（c）chitosan ionic strength，（d）ζ-potential and size of each layers

2.2 CaCO3微球与（HEP/CHI）5微胶囊形貌观察

随后对微胶囊形貌特征和粒径变化进行了观察。从形貌上看，SEM图2（a）中CaCO3内核具有适于微胶囊制备的球霰石晶体微球形态[15-16]，结构致密。TEM图2（b）显示（HEP/CHI）5微胶囊为多孔松散的膜结构，表明这种微胶囊可能具有较强渗透性。CLSM图2（c）中还可观察到这种药物载体是内有空腔的圆形胶囊结构。

从粒径变化来说，图1（d）显示在LbL自组装过程中微球的尺寸基本都保持在4 μm左右，没有随胶囊壁的组装而大幅增加。由CaCO3球SEM图2（a）可知，CaCO3微球模板尺寸大约在3.9 μm左右，两者差别较小，可推断微胶囊尺寸大小主要由模板的尺寸决定。另外TEM图2（b）中微胶囊的粒径大约在4.2 μm，CLSM图2（c）中粒径却大约为5.2 μm。这种尺寸变化可能是由于CaCO3模板去除后微胶囊内腔中无机离子浓度增加使渗透压增加，从而使微胶囊发生膨胀的缘故，表现在CLSM图2（c）中微胶囊尺寸偏大。拍摄TEM图像时微胶囊脱水又导致它收缩并塌陷，微胶囊尺寸缩小。

图2 FITC荧光标记微胶囊中HEPFig.2 （a）SEM observation of CaCO3template，（b）TEM and（c）CLSM images of（HEP/CHI）5microcapsule labelled by FITC

2.3微胶囊的抗凝血活性和毒副作用

如图3（a）（b）所示，0 h时所有试管中血液均为未凝固状态，但1 h后生理盐水和0.1、0.5 g/L微胶囊试管中血液已经凝固，肝素和2 g/L微胶囊试管中血液没有凝固，这说明（HEP/CHI）5微胶囊具有抗凝血功效，能够延长凝血时间。

为了进一步研究 （HEP/CHI）5微胶囊的抗凝血效果，使用APTT法测试了不同释放时间后微胶囊悬液的抗凝血时间。对比于对照组生理盐水（37±1）s的凝血时间，不同时间后的微胶囊悬液都能延长血浆的凝血时间，1 h后微胶囊悬液的抗凝血时间延长（11±3）s，而24 h后的抗凝血时间则为（90±6）s左右。这表明微胶囊的抗凝血功效依赖于肝素的释放。此外，如图3（c）所示，随着微胶囊质量浓度的增大，抗凝血时间也逐渐延长，并且微胶囊的质量浓度与抗凝血效果呈正相关。

另外，由图3（d）内皮细胞ECs的MTT细胞毒性结果可知，（HEP/CHI）5微胶囊对ECs细胞几乎没有毒性，说明这种微胶囊毒副作用极小。

2.4 微胶囊稳定性

为了研究 （HEP/CHI）5微胶囊在胃肠道中的稳定性，利用肝素在pH 5.0和7.4条件下的体外释放行为，检测微胶囊在十二指肠（pH 4.2～8.2）和肠道（pH 7.4）环境的稳定性。微胶囊中肝素载药率为（37.5±0.3）%。如图3（e）所示，两种pH下肝素都以极缓慢的速率释放，到24 h后HEP的释放量还不足微胶囊中肝素总量的30%。这说明该微胶囊在pH 5.0和7.4条件下是稳定的。

图3 血液中加入微胶囊Fig.3 Blood coagulation state after（a）0 h and（b）1 h，（c）Impact of microcapsule concentration on anticoagulanteffect，（d）ECs cellcytotoxicity assay，（e）Heparin release behavior

此外，还进一步检验了（HEP/CHI）5微胶囊在模拟胃液或模拟肠液中的稳定性，如图4所示。在经过4 h模拟胃液或模拟肠液处理后，微胶囊依然保持良好的圆环形状，绝大部分微胶囊都未被降解。由此可以推断，该微胶囊对胃肠道环境应当具有稳定性，有望作为口服剂型用于肝素给药。

3 结语

在口服药物的研究中，药物胃肠道的吸收通常有4个主要影响因素——药物的溶解性、稳定性、膜通透性和首过效应[17]。一方面，药物的溶解性和稳定性可以通过药物传递技术进行调节；另一方面，表面活性剂等吸收促进剂可以改善药物的跨胃肠道黏膜转运，提高药物的生物利用度[17]。

图4 （HEP/CHI）5微胶囊的FITC荧光标记图像（标尺为10 μm）Fig.4 Fluorescence images of FITC labelled（HEP/CHI）5microcapsules incubating in（a）PBS，（b）simulated gastric fluid or（c）simulated intestinal fluid（The scale bar was 10 μm）

本文作者设计的微胶囊可以在胃肠道中为HEP隔离周遭不利环境，提高了HEP的稳定性。另已有文献报道，CHI是一种具有良好生物相容性的黏膜传递吸收促进剂[10]，可以促使紧密连接的结构蛋白质（ZO-1、闭合蛋白质）和细胞骨架蛋白质（F-肌动蛋白质）等重新分布，改变上皮细胞的紧密连接和细胞骨架，使药物能够跨上皮黏膜传递[8]。CHI的促进作用有可能增强HEP在胃肠道中的渗透吸收。此外，在微胶囊的LbL制备工艺中，常规载药方式制得的微胶囊往往在最初几个小时将大部分HEP释放。但在人机体内低质量浓度HEP就已经具备预防血栓形成的功效[18]。Frank Caruso等人[19]提出的膜间载药新方式，将更适合微胶囊中HEP缓慢释放的需求。

根据上述思路制备的（HEP/CHI）5微胶囊，不仅有可能促进肝素的胃肠道吸收，有效地减缓HEP释放速率，并延长它在血液中的循环时间，还具有促进HEP口服吸收的潜力，有望作为口服剂型用于肝素给药，具有很大的市场前景。

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Preparation of Heparin/Chitosan Microcapsule for Anticoagulation Study

LIANG Yan， SONG Jiahong， CHEN Jingxiao， CHEN Jinghua*
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Heparin/chitosan（HEP/CHI）5microcapsules for anticoagulation were prepared by Layerby-layer（LbL）technique.The stability of（HEP/CHI）5microcapsules under pH 5.0 and 7.4，simulated gastric and intestinal juices conditions was studied respectively，APTT anticoagulant time and cytotoxicity of microcapsules against endothelial cells were estimated.Results indicated that（HEP/CHI）5microcapsuleswere ofsphericalstructure and stable in differentsimulated physiological milieus；they could behave favorable anticoagulant efficacy with no significant cytotoxicity.Thus，（HEP/CHI）5microcapsules were promising for clinical heparin administration as a novel oral dosage form.

microcapsule，heparin，anticoagulation，LBL，oral dosage form

R 944.9

A

1673—1689（2015）03—0295—07

2014-04-11

教育部博士点基金项目（20110093110008）；江苏省自然科学基金项目（BK2012557）。

*通信作者：陈敬华（1971—），男，湖北黄石人，理学博士，教授，博士研究生导师，主要从事生物大分子和生物功能材料的研究。

E-mail：jhchenwhut@126.com