基于Au/SiO2信号放大的人免疫球蛋白G电化学检测新方法

倪郦丽， 宋靓婧， 马小媛， 吴世嘉， 段 诺， 王周平

（江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

基于Au/SiO2信号放大的人免疫球蛋白G电化学检测新方法

倪郦丽， 宋靓婧， 马小媛， 吴世嘉， 段 诺， 王周平*

（江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

将人免疫球蛋白G（人IgG）固定到导电玻璃ITO表面，利用抗原抗体有特异性结合制备出一种电化学免疫传感器。在导电玻璃ITO表面进行氨基化戊二醛修饰处理后，链接羊抗人IgG；在二氧化硅微球表面进行氨基戊二醛化，2~5 nm纳米金通过静电吸附在二氧化硅微球表面，利用H2O2进一步将纳米金还原后粒径变大，链接羊抗人IgG。基于Au/SiO2信号放大效应，利用人IgG对羊抗人IgG的特异性结合作用，人IgG分别与导电玻璃端和纳米材料端相结合，形成三明治夹心结构，建立了一种检测人IgG的电化学免疫新方法。电极表面的氧化还原峰电流值与人IgG的浓度在1~200 ng/mL内呈良好的线性关系，线性回归方程为y=-0.532 6x+ 409.256 7，相关系数R2=0.994 8，检测限为0.6 ng/mL。该电化学免疫传感器实现了对人免疫球蛋白G低成本、超灵敏的检测，有望应用于人体血清检测。

食品检验；二氧化硅；人免疫球蛋白G；循环伏安法

电化学免疫分析法是将免疫分析与电化学分析技术相结合的一种免疫分析新方法。免疫分析主要是基于用抗体（或抗原）作为选择性化学试剂以分析测定抗原（或抗体）及半抗原。目前最广泛的免疫检测技术有免疫酶联吸附试验（ELISA），免疫荧光技术（IFA），免疫凝集试验（IA）和免疫沉淀（IP），在生物检测领域它们发挥了极其重要的作用[1]。

电化学免疫检测技术是一种微量检测新技术，主要用于生物活性物质如抗原、抗体、激素等的检测。它将免疫反应的特异性和微电子技术结合，使免疫检测具有精度高、速度快、适合于小型化和集成化，显示了广阔的发展前景[2-6]。

近年来，纳米材料的出现在科学研究领域给人们以新的视野。纳米材料的结构决定了其产生的特殊效应，这是常规材料无法具有的性能[7]。随着人们对其研究愈来愈深入，人们已成功制备出各种纳米材料，纳米材料具有良好的导电性和宏观隧道效应，既能作为导线连接在生物分子与电极之间，又能起到加快异相界面电子传递速率的作用，增加了氧化还原物质在电极表面反应的可逆性，是优良的电极或电极修饰材料[8-9]。二氧化硅纳米材料由于其具有比表面积大、表面活性中心多、良好的单分散性、生物兼容性以及易功能化的特性被广泛应用到各个领域[10-11]。纳米金因为其吸附能力强，具有良好的稳定性和催化性能和导电性，而且能为蛋白质提供一个与本体环境相似的微环境，也有助于蛋白质与电极表面之间的直接电子转移而被广泛应用[12-14]。此外，纳米金在分析检测方面有着广泛的应用，如李井泉等[15]利用纳米金标记黄曲霉毒素B1检测AFB1。

免疫球蛋白G是主要存在于人体血浆中含量最高的抗感染抗体，约占总免疫蛋白的70%~75%，其含量的高低往往作为慢性感染、慢性肝病、免疫性疾病等疾病的参考值，所以对其含量检测意义重大。现有对人免疫球蛋白G检测方法有压电免疫传感器技术、酶免疫法和荧光免疫法等[16]。

作者通过构建电化学免疫传感器用于检测人免疫球蛋白G（人IgG），利用抗体-抗原的特异性结合反应，使得导电玻璃ITO表面链接羊抗人IgG，羊抗人IgG标记SiO2/GNPs纳米复合颗粒，利用人IgG对羊抗人IgG的特异性结合作用，人IgG分别与导电玻璃端和纳米材料端相结合，形成三明治夹心结构，基于Au/SiO2信号放大效应，实现对人IgG的电化学检测。通过紫外分光光度计（UV-1800）、傅里叶红外光谱（FT-IR）、透射电子显微镜（TEM）、以及电化学方法表征从而实现对人IgG的免疫分析，建立了一种检测限低，灵敏度高的检测新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羊抗人IgG（AB-0011）、人IgG（AG-0011）：购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；氯金酸（HAuCl4）、导电玻璃ITO：购自深圳华南湘城科技有限公司；人血清：江南大学校医院提供；氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、碳酸钠（Na2CO3）、铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]）、硼氢化钠（NaBH4）、亚铁氰化钾（K4Fe（CN）6·3H2O）、碳酸钾（K2CO3）、双氧水（H2O2）、浓氨水、正硅酸四乙酯（TEOS）、戊二醛、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、无水乙醇、丙酮、氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）：均购自国药化学试剂，所用试剂均为分析纯，实验所用水为超纯水。

紫外分光光度计 （UV-1800），JEM-2100HR透射电子显微镜：日本JEOL公司产品；三电极体系：导电玻璃ITO工作电极、铂丝对电极、银/氯化银参比电极；CHI660D电化学工作站：上海辰华仪器有限公司产品；HH-4数显恒温水浴锅：常州荣冠实验分析仪器厂产品；DF-101S型集热式磁力加热搅拌器：河南巩义市予华仪器厂产品；Direct-Q3超纯水制备仪：美国Millipore公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 ITO导电玻璃的修饰ITO导电玻璃经洗涤剂、超纯水、丙酮、无水乙醇各超声15 min，氮气吹干后放于体积分数1%APTES的无水乙醇中，37℃反应12 h，用无水乙醇超声洗涤5次，置于120℃烘箱中放置3 h。

将氨基化处理的ITO浸入pH7.4的缓冲溶液中常温放置20 min，氮气吹干。再将ITO放于体积分数5%的戊二醛的PBS溶液中常温反应2 h，用PBS、超纯水洗涤后氮气吹干，再将ITO放于质量浓度为400 ng/mL的羊抗人IgG溶液中，37℃摇床反应1 h后用超纯水洗涤3次，氮气吹干。

1.2.2 抗体标记的SiO2/GNPs的制备

1）二氧化硅的制备 参照Stober[17]溶胶-凝胶法方法，在20 mL无水乙醇和10 mL超纯水中，加入5 mL氨水，混匀加入1.5 mL TEOS和5 mL无水乙醇，待磁力搅拌器温度升至30℃后，恒温磁力搅拌器搅拌12 h后，加入400 μL的APTES，继续搅拌2 h，离心洗涤加入体积分数25%的戊二醛溶液，常温条件下磁力搅拌2 h，7 200 r/min离心10 min，重复以上操作3~4次重新分散于PBS中。

2）纳米金的制备 将预冷的200 mL超纯水置于磁力搅拌器上，加入体积分数1%的HAuCl43 mL、0.2 mol/L的K2CO3溶液1 mL，搅拌均匀后迅速加入9 mL的0.5 mg/mL NaBH4。待溶液由最初的浅黄色变成酒红色，继续搅拌10 min，得到2~5 nm粒径的纳米金。

3）SiO2/GNPs的制备 取上述制备的戊二醛化的SiO22 mL超声分散于20 mL的超纯水中，逐滴加入到纳米金溶液中，持续搅拌1 h，离心清洗后超声分散得到SiO2/GNPs。稀释SiO2/GNPs溶液使得紫外吸收值2.5，得到满足浓度的SiO2/GNPs溶液。

称取25 mg K2CO3溶于100 mL超纯水中，磁力搅拌10 min，加入体积分数1%的HAuCl4溶液1.5 mL，持续搅拌20 min，得到Au/K2CO3生长溶液置于4℃冰箱保存备用。在20 mL的SiO2/GNPs溶液中，加入240 mL的Au/K2CO3与4 mL 0.132 mol/L的H2O2水溶液，常温条件下磁力搅拌20 min后，3 000 r/min离心30 min，重复以上操作3~4次后超声得到大粒径的SiO2/GNPs纳米复合颗粒，加入0.02 mg/mL浓度的羊抗人IgG 2 mL，37℃摇床中反应1 h，3 000 r/min转速离心30 min，重复3次后超声分散于超纯水中，稀释SiO2/GNPs/羊抗人IgG溶液使得紫外吸收值2，得到满足浓度的SiO2/GNPs/羊抗人IgG溶液，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.3 电化学检测配制铁钾电解液：准确称取KCl：7.45 g、K3[Fe（CN）6]：0.329 g、K4[Fe（CN）6]：0.422 g，定容至100 mL。

链接羊抗人IgG的ITO与不同浓度的人IgG，37°C摇床反应1 h后用超纯水充分洗涤3次，以除去非特异性吸附的人 IgG，再加入 0.1 mL SiO2/ GNPs/羊抗人IgG溶液，37℃特异性结合反应1 h后，再用超纯水充分清洗除去非特异性吸附的纳米复合颗粒，形成三明治型免疫复合结构。将三电极系统 （以ITO三明治型免疫复合物为工作电极，以银/氯化银为参比电极，以铂丝为对电极）置于上述所制电解液中，起始电压设定为-0.2 V，扫描速率为100 mV/s，开机预热后30 min后，用循环伏安法和阻抗频谱法对ITO链接的免疫复合材料进行检测。

2 结果与讨论

2.1 实验原理设计图

图1所示为基于Au/SiO2信号放大的人免疫球蛋白G电化学免疫传感检测原理图。导电玻璃经过氨基化以及戊二醛修饰后成功链接羊抗人IgG；参考Stober[17]溶胶-凝胶法制备的二氧化硅微球同样经过氨基化戊二醛修饰后，将预先制备的2~5 nm纳米金通过静电吸附作用均匀的吸附在二氧化硅微球表面，H2O2将2~5 nm的纳米金还原后，纳米金的粒径变大以增大电化学信号，通过戊二醛链接作用成功修饰羊抗人IgG。利用抗原抗体的特异性结合作用，将修饰了羊抗人IgG的导电玻璃、人IgG、羊抗人IgG修饰的纳米材料三者形成三明治夹心结构，用电化学方法进行表征，成功建立了检测人IgG的电化学免疫传感器。

2.2 ITO表面修饰以及表征

利用循环伏安法对导电玻璃ITO每步修饰做了表征。从图2可以看出，空白导电玻璃ITO由于没有链接任何物质，空白导电玻璃ITO导电性最强，电流强度最大，随着依次在导电玻璃ITO表面修饰上氨基、戊二醛、羊抗人IgG、人IgG后，使ITO表面阻值逐渐增大，导电性能减弱，相应的峰电流值不断减下（如图2中曲线a、曲线b、曲线d、曲线e、曲线f），也同时证明了导电玻璃ITO表面修饰成功。最后，当链接了人IgG的导电玻璃与SiO2/GNPs/羊抗人IgG反应链接后，电流强度有明显增大趋势（图2中曲线c所示），这是由于SiO2表面静电吸附的纳米金具有导电性，促进电子的传递，从而能达到信号放大的作用。

2.3 SiO2纳米材料表面修饰表征

图3是SiO2的透射电子显微镜图，可以看出在乙醇相中分散性良好，粒径大小约为80 nm，相对比较均一。图4是氨基化的SiO2红外表征图，SiO2纳米颗粒的非对称Si-O-Si伸缩振动峰显示在最强的吸收峰1 099 cm-1处，3 433 cm-1是强吸收峰为NH的伸缩振动吸收峰，1 633 cm-1处的振动吸收峰为一级胺的N-H剪式振动吸收峰，红外图谱表明在SiO2纳米材料表面已经成功修饰上氨基。

2.4 H2O2还原前后的Au/SiO2表征

图5（a）是纳米金颗粒已经通过静电吸附作用成功吸附在SiO2纳米材料表面，形成Au/SiO2纳米复合材料。Au/SiO2通过H2O2的还原性作用将包覆在SiO2表面的纳米金颗粒增大。图5（b）显示经H2O2还原后，SiO2纳米材料外包覆的纳米金颗粒有明显增大趋势。

图3 氨基化SiO2纳米材料的TEM图Fig.3 TEM image of SiO2NPs

图4 氨基化SiO2纳米材料的红外图谱Fig.4 IR spectra of amine-functionalized SiO2NPs

图5 Au/SiO2纳米复合材料（a）与H2O2还原后Au/SiO2纳米复合材料（b）的TEM图Fig.5 TEM image of Au/SiO2NPs（a）and Au/SiO2reducted by H2O2（b）

图5是Au/SiO2复合材料经H2O2还原前后紫外可见吸收对比图。未经H2O2还原的Au/SiO2纳米复合材料在520 nm处有明显紫外吸收峰，经H2O2还原作用后，纳米金颗粒粒径增大，在570 nm处有明显紫外吸收峰，吸收峰明显红移，这是因为纳米金的粒径大小与紫外可见吸收峰有一定关系，随着纳米金粒径变大，纳米金的最大紫外吸收波长就会发生红移。因为SiO2微球表面的纳米金粒径增大使得纳米金量增多，紫外可见吸收峰强度增强。证明H2O2成功还原Au/SiO2，可应用于后续实验。

图6 H2O2还原前Au/SiO2与H2O2还原后Au/SiO2紫外可见吸收对比图谱Fig.6 UV-visibleabsorption spectrum ofAu/SiO2reducted by H2O2compared with Au/SiO2

2.5 反应条件优化

考察人IgG与ITO/羊抗人IgG特异性结合的免疫反应时间对循环伏安电流的影响。如图7表明，当人IgG溶液加入到链接了羊抗人IgG的导电玻璃中后，结合时间从20 min延长到80 min，随着孵育时间延长，人IgG与羊抗人IgG结合量越多，整体阻值不断变大，循环伏安电流强度逐渐减小，当时间大于60 min后，循环伏安电流值降到最小，时间继续延长响应电流趋于平稳，说明当孵育时间为60 min时，人IgG与导电玻璃ITO表面羊抗人IgG之间的特异性结合基本完成。因此孵化时间选为60 min。

图8为检测孵育温度20~45℃的响应电流信号，发现随着温度的不断升高，人IgG与羊抗人IgG特异性结合越充分，阻值增大进而使得循环伏安电流值不断减小，当温度超过了37℃以后信号有小幅上升，这是由于在37℃条件下，ITO/羊抗人IgG与人IgG结合效果量达到最大值，导电玻璃链接物质达到最大使得阻值最大，因而循环伏安电流值最小，选择37℃为最佳孵育温度。

图7 ITO表面羊抗人IgG与人IgG不同孵育时间的循环伏安电流强度Fig.7 Cyclic voltammograms current value of different incubation time of the reaction of second antibody and antibody on the ITO

图8 不同孵育温度条件下循环伏安电流值Fig.8 Cyclic voltammograms current value of different incubation temperature

2.6 人免疫球蛋白G的检测

将人IgG稀释，分别选取人IgG质量浓度为空白、0.01、0.1、1、10、100、150、200、250、350 ng/mL。如图9中所示，随着在电化学免疫传感器中人IgG质量浓度的不断增大，阻抗图中的半径逐渐增大即阻抗不断增大，相应的在图10中显示为氧化还原峰电流值不断减小，这是因为随着免疫传感器中人IgG质量浓度不断增多，导电玻璃ITO表面链接的复合物质也会不断增多，因而导致了免疫传感器中氧化还原峰电流值不断减小。图11表明，氧化还原峰电流值与人IgG质量浓度在1~200 ng/mL范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为y=-0.532 6x+ 409.256 7，相关系数R2=0.994 8，检测限为0.6 ng/mL。

图9 1～350 ng/mL人IgG的阻抗频谱图Fig.9 Impedance spectrum of 1～350 ng/mL of immunoglobulin G

图11 检测人IgG标准曲线Fig.11 Correlation of detection immunoglobulin G

2.7 实际血样中人IgG的检测

正常人血清中人免疫球蛋白G含量在8~14 g/L，取正常人血清用0.01 mol/L的PBS缓冲溶液稀释至检测限线性范围内后，用以上制备的免疫传感器测得 5个样品中人IgG质量浓度分别为9.2、10、7.9、8.3、9.1 g/L，向每个人血清样品中加入人IgG标准品 9 g/L，测得回收率分别为 96.2%、98.8%、101.6%，、97.7%、94.5%（表1）。结果表明，该实验方法可用于实际样品的检测。

表1 人血清中的IgG浓度检测结果Table 1 Results of IgG decetion in human serum

3 结语

作者构建了一种简单灵敏的电化学免疫传感器，采用三明治夹心型模式检测人免疫球蛋白G。此传感器利用ITO低成本，低阻值，结合金纳米粒子良好的导电性得以信号放大的优点，极大的提高了灵敏度。此电化学免疫传感器稳定性好，可有效改善电极表面的生物相容性和电子传递速率，可实现对人体血清中免疫球蛋白G的检测。

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New Method of Electrochemical Immune Detection of Immunoglobulin G

NI Lili， SONG Liangjing， MA Xiaoyuan， WU Shijia， DUAN Nuo， WANG Zhouping*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To develop a novel electrochemical immune biosensor based on antigen-antibody reaction with the immunoglobulin G immobilized the surface of the ITO.The side of ITO was immobilized the goat anti-human IgG after the amino-modified and glutaraldehyde modification. The side of SiO2also had the same modification of amino and Glutaraldehyde，and then 2~5 nm gold nanoparticles adsorbing the surface of SiO2by the use of electrostatic interaction.We immobilized the goat anti-human IgG after the reduction of H2O2with bigger gold nanoparticles. When human IgG respectively combined with the ITO and nanomaterials，it would form the sandwich structure of a new detection of immunoglobulin G based on Au/SiO2to amplify signal amplification.The prepared biosensorshowed a excellentlinearity relationship ofCyclic voltammograms current value and the concentration of immunoglobulin G 1~200 ng/mL，theequation of linear regression is y=-0.532 6x+409.256 7（R2=0.994 8），with a detection limit of 0.6 ng/mL.The established method is low cost and ultrasensitive，and can be used to detect immunoglobulin G.

food analysis，silicon dioxide，immunoglobulin G，cyclic voltammetry

R 392-33

A

1673—1689（2015）01—0047—07

2014-03-22

教育部高等学校自主科研重点项目（JUSRP51309A）；教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET-11-0663）；教育部博士点博导基金（20110093110002）；江苏省科技支撑-社会发展项目（BE2012614）。

*通信作者：王周平（1974—），男，陕西宝鸡人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事食品安全检测研究。E-mail：wangzp@jiangnan.edu.cn