Pim-1在非小细胞肺癌中的表达及其与c-Myc的相关性

刘星宏，温桂兰

(南昌大学第一附属医院呼吸与危重症医学科 330006)

论著·基础研究

Pim-1在非小细胞肺癌中的表达及其与c-Myc的相关性

刘星宏，温桂兰△

(南昌大学第一附属医院呼吸与危重症医学科 330006)

目的 研究原癌基因Pim-1在非小细胞肺癌及癌旁正常组织中的表达情况及其与c-Myc的相关性。方法收集该院胸外科手术切除的非小细胞肺癌患者的肺癌及癌旁正常肺组织标本各30例，统计临床病例资料及跟踪后期病理结果，利用RT-PCR、qRT-PCR及免疫组织化学方法检测肺癌及癌旁正常组织中Pim-1 mRNA、c-Myc及Pim-1蛋白的表达，分析Pim-1表达与临床病理特征及c-Myc表达的相关性。结果在非小细胞肺癌中Pim-1阳性率、mRNA及蛋白表达量明显高于癌旁组织，mRNA表达量分别为0.798±0.083 和0.394±0.107 (P<0.01)，蛋白阳性例数分别为18例及6例(P=0.002)。Pim-1蛋白的表达与非小细胞肺癌患者的年龄差距、性别差异、有无吸烟史、肿瘤病理类型及分化程度无关(P>0.05)，但与有无淋巴结转移及肿瘤的TNM分期有关(P<0.05)，有淋巴结转移及TNM分期升高，其表达量也随之上调。Pim-1与c-Myc蛋白表达呈正相关，相关系数(r)为0.433(P=0.017)。结论Pim-1在非小细胞肺癌组织中呈高表达趋势，且随着存在淋巴结的转移及TNM分期的升高，其表达也随之增加。

癌，非小细胞肺；原癌基因蛋白质c-Pim-1；靶向治疗

随着全球空气污染日趋严重，易感人群增多，以呼吸道为媒介而导致的肺部疾病日趋增多，其中以肺癌的发病率上升为主要体现。世界卫生组织2003年公布的资料显示，肺癌患者逐年增加，无论是发病率还是病死率来看，肺癌毫无疑问成为全球最常见、最主要的恶性肿瘤之一。原癌基因Pim-1是Pim基因家族(目前发现的有Pim-1、Pim-2和Pim-3)中的一员，其过表达能够抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、影响基因组稳定性。国内外已有多项研究证实Pim-1基因的表达上调与诸多实体瘤的发生、发展相关[1-4]，而在非小细胞性中的表达及其可能发挥的作用在国内外鲜有研究，研究已证实c-Myc蛋白在肺癌组织中过度表达，并与其恶变程度呈正相关[5]。鉴于对c-Myc基因目前研究相对更成熟，作用机制以及影响因素等方面探究得也相对明朗，本研究运用RT-PCR、qRT-PCR及免疫组织化学方法从基因及蛋白两个水平上检测Pim-1在非小细胞肺癌组织中的表达，并进一步分析目的基因与肺癌临床病理特征之间的关系；再结合c-Myc这种目前研究较成熟的基因，通过分析两种原癌基因之间的相关性来初步探讨Pim-1在非小细胞肺癌发病机制中的作用及其与c-Myc表达的关系，为临床上早期诊断肺癌、评估预后及基因治疗方面，奠定实验基础、提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 标本来源 选择2011年1月至2012年1月在本院胸外科行手术切除的非小细胞肺癌患者30例，收集病灶及癌旁正常肺组织(距离肿瘤边缘大于5 cm)标本，确保患者术前均未接受手术、放化疗及生物靶向治疗，且所有入选标本均经本院病理科医生术后病理证实为非小细胞肺癌。所收集的标本临床病理特征，均由后期在病案室查看病历资料及病理科查看术后组织病理报告收集获取。

1.2 试剂 总RNA提取试剂Trans Zol试剂盒、重组核糖核酸酶抑制剂、M-MLV第一链合成系统试剂盒及PCR扩增试剂盒为Invitrogen公司产品；qRT-PCR染料购自TaKaRa公司；引物由Invitrogen公司合成。Pim-1、c-Myc一抗抗体为北京博奥森公司产品；Two-Step IHC Detection Reagent购自北京中杉金桥公司。

1.3 方法 RT-PCR及qRT-PCR均严格按照试剂盒逐步操作，设计合成的Pim-1引物：F：5′-GAG GTT GGG ATG CTC TTG TC-3′；R：5′-GCG GAT GCC TGA GTA GAC C-3′。用OD×mm(Pim-1)/OD×mm(GAPDH) 这一计算公式计算出目的基因 Pim-1 mRNA的相对表达量；qRT-PCR检测以GAPDH作为内参对照，以2-△△Ct表示实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，实验重复3次。免疫组织化学采用非生物素二步法，一抗浓度为1∶200，采用DAB显色，阳性染色如下：细胞核和(或)细胞质出现淡黄色至黄棕色或棕褐色。评分标准参照文献[6]中的方法。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计数资料以率表示，采用χ2检验或Fisher′s确切概率法进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Pim-1 mRNA表达水平 在非小细胞肺癌组织中Pim-1 mRNA表达量明显高于癌旁正常组织，30例肺癌组织标本中Pim-1 mRNA表达阳性(图1)21例，相应癌旁组织阳性7例，阳性表达率分别为70.0%和23.3%，差异有统计学意义(χ2=13.125、P=0.000)；同时Pim-1 mRNA相对表达量(OD值检测)在非小细胞肺癌组织中(0.798±0.083)也显著高于癌旁正常组织(0.394±0.107)，其差异也有统计学意义(t=11.521、P<0.01)。单因素方差分析的结果表明，非小细胞性肺癌中Pim-1基因的表达差异有统计学意义(F=2.16，P<0.01)，Durmett-t检验显示Pim-1基因在非小细胞肺癌中的表达水平(7.648±1.231)与癌旁组织(12.141±1.871)相比差异均有统计学意义(P<0.05)，免疫组化的结果显示(图2)：在30例非小细胞肺癌组织中Pim-1蛋白阳性表达18例，阳性率为60%，差异有统计学意义(χ2=10.000、P=0.002)。

1：DNA Marker；2：阴性对照；3～5：肺癌组织；6～8：癌旁组织；9：空白。

图1 RT-PCR检测Pim-1 mRNA表达水平

2.2 Pim-1的表达与临床病理特征的关系 采用Fisher确切概率法进行分析Pim-1表达与各病理特征间关系(表1)，肺癌中Pim-1的表达与患者年龄、性别、吸烟史、病理分化程度及类型等没有明显的联系(P>0.05)，与淋巴结转移及TNM分期关系密切，呈正相关(P<0.05)。

A:肺癌组织;B:癌旁组织。

图2 Pim-1的表达(×200)

表1 Pim-1的表达与临床病理特征的关系

A：肺癌组织；B：癌旁组织。

图3 两组标本中c-Myc的阳性表达(×200)

2.3 非小细胞性肺癌组织中Pim-1及c-Myc蛋白表达的呈正相关 30例标本中c-Myc阳性表达(图3)20例，阳性率为66.7%，癌旁组织阳性表达11例，阳性率为30.0%，差异有统计学意义(χ2=8.076、P=0.04)。结果证实Pim-1及c-Myc在非小细胞肺癌组织中存在表达，二者共同表达阳性例数为15例，共同表达阴性例数为7例，采用Spearman等级分析进行相关性分析，r=0.433，P<0.05，具有正相关关系。

3 讨 论

3.1 Pim-1与非小细胞肺癌 Pim-1蛋白隶属于丝氨酸/苏氨酸家族3个成员之一，具有高保真性及自身组成性激活突变型[7-9]，可编码2种不同的Pim-1蛋白产物，在3′-非编码区域存在活性因子聚集，可以导致终止密码子的嵌入，引起复制过程中的A/U富集平衡破坏，使得原本较低水平的Pim-1表达上调[10-11]。研究发现，Pim-1的磷酸化在细胞分型、分化和细胞凋亡中起着重要作用，在抑制细胞凋亡和促进细胞增殖中也起着重要作用[12]。本研究发现在mRNA及蛋白水平非小细胞肺癌中癌组织Pim-1表达水平均明显高于癌旁正常组织，相关临床病理特征显示Pim-1蛋白表达量与患者的年龄、性别、吸烟史、肿瘤病理类型及分化程度等临床特征无关，与有无淋巴结转移及肿瘤TNM分期关系密切，且呈正相关关系，因此作者推测Pim-1很可能在很大程度上参与了非小细胞肺癌的浸润和转移，为临床预测预后提供理论依据。

3.2 Pim-1与c-Myc的协同作用 Pim-1与c-Myc强大的联合作用效应最早是在淋巴瘤形成的研究中发现的，随后发现Pim-1在人类前列腺癌组织中具有高表达，并且其高表达能加强在人类前列腺肿瘤细胞株中致癌效应[13]，研究发现Pim-1与c-Myc共同作用参与前列腺癌的产生和进展，其中可能的作用机制是Pim-1基因增强c-Myc的转录活性，进而参与细胞增殖的调控。虽然Pim-1与c-Myc表达发挥致癌效应的分子学机制目前尚未明确，但可以明确c-Myc磷酸化作用可以延长Pim-1半衰期[14]。此外，Pim-1的高表达可以通过作为c-Myc基因的辅因子进而加强c-Myc的复制转录活性。本研究采用免疫组织化学法检测了在30例非小细胞肺癌中Pim-1与c-Myc的蛋白表达量。结果显示，c-Myc蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达量显著高于癌旁正常组织，且2个基因存在正相关作用，在30例非小细胞肺癌组织中，18例Pim-1表达阳性，20例c-Myc表达阳性，其中15例二者均表达阳性，7例均表达阴性。因此作者推测二者在肺癌的发生、发展过程中关系密切，且相互促进，并进一步证实了Pim-1可能在非小细胞肺癌的发生发展过程中发挥了重要作用。

3.3 Pim-1可能成为非小细胞肺癌诊治的新靶点 Pim-1在越来越多的肿瘤组织中被发现，如胰腺癌、胃癌、结直肠癌等，表明Pim-1在各种不同类型肿瘤中的表达相对稳定，敏感性较高，在某种情况下，肿瘤中检测到Pim-1的表达往往提示预后不良[14]。近年来Pim-1的高表达影响肿瘤发生发展的分子学机制逐渐成为了研究热点。体外实验证实Pim-1过表达可以加强肿瘤的发生发展，并能阻止药物诱导肿瘤细胞的凋亡能力[2-3]。本研究发现Pim-1在非小细胞肺癌中的表达量明显高于非癌变的正常组织，与前人研究结果一致。说明Pim-1基因作为特异性的肿瘤标记物是可行的，因此，作者推测在非小细胞肺癌的早期发现、早期诊断中，Pim-1也是一个潜在的、重要的、有效的肿瘤标记物。并且针对该基因的小分子化学药物抑制剂，抑或相关的单克隆抗体等也能成为除放化疗治疗方案以外重要的二、三线靶向治疗途径，这可以为丧失了手术切除治疗机会的晚期肺癌患者带来福音。

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[14]Kim J,Roh M,Abdulkadir SA.Pim1 promotes human prostate cancer cell tumorigenicity and c-MYC transcriptional activity[J].BMC Cancer,2010,248(10):3349-3356.

The expression of Pim-1 in non-small cell lung cancer and its relationship with c-Myc

LiuXinghong,WenGuilan△

(DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective To investigate the expression of Pim-1 in non small cell lung cancer and adjacent normal tissues,and study the relationship between c-Myc and Pim-1 in the corresponding tissue gene expression.Methods Totally 30 cases of non small cell lung cancer tissue and adjacent normal lung tissues were collected by surgical operation in department of thoracic surgery.Clinical data were statisticed and tracking late pathologic results,using RT-PCR,qRT-PCR and immunohistochemical method to detect Pim-1 mRNA,c-Myc and Pim-1 protein expression in lung cancer and adjacent normal tissue,and to analyze the relationship between the expression of Pim-1 and c-Myc.Results The positive rate of Pim-1 mRNA and protein expression in non small cell lung cancer was obviously higher than that in adjacent normal tissue,the mRNA expression levels were 0.798±0.083 and 0.394±0.107 (P<0.01),the protein positive cases were 18 cases and 6 cases (P=0.002).The expression of Pim-1 protein had no relationship on age,gender,smoking history,pathological types and degree of differentiation of patients with non-small cell lung cancer (P>0.05),bue had related to ymph node metastasis and TNM stages of tumor (P<0.05),with lymph node metastasis and TNM stages increases,its expression quantity also rise.There was a positive correlation between Pim-1 and c-Myc protein expression,correlation coefficient (r) was 0.433 (P=0.017).Conclusion High expression of Pim-1 in non small cell lung cancer gene and is also increased with lymph node metastasis and TNM stages,Pim-1 and c-Myc expression has positive correlation,this could provide clues to the early diagnosis and prognosis evaluation of non small cell lung cancer,and also provides a new train of thought and to find a new target for gene therapy of lung cancer.

carinoma,non-small-cell lung;pro-oncogene proteins c-pim-1; targeted therapy

刘星宏(1988-)，硕士，住院医师，主要从事非小细胞性肺癌的诊疗、呼吸系统感染方面的研究。

△通讯作者，E-mail:13707089818@163.com。

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.15.005

A

1671-8348(2015)15-2031-03

2014-11-08

2015-02-16)