4味中草药的体外抗TGEV试验

卫文强，吴 润，刘 磊

(1 甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070；2 河南大学 医学院，河南 开封 475004)

4味中草药的体外抗TGEV试验

卫文强1,2，吴 润1，刘 磊1

(1 甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070；2 河南大学 医学院，河南 开封 475004)

【目的】 探讨黄芪、黄芩、大黄、金钱草体外对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的抑制作用。【方法】 采用传统的水提法制备黄芪、黄芩、大黄、金钱草等中药的提取液，测定其对PK-15细胞的最大安全质量浓度。采用细胞病变观察法确定4味中草药对TGEV致PK-15细胞病变的抑制作用，并通过MTT法计算药物的最小抗病毒质量浓度和抑制指数。【结果】 黄芪、黄芩、大黄、金钱草的最大安全质量浓度分别为50，12.50，6.25和6.25 mg/mL。黄芩、黄芪能抑制TGEV对PK-15细胞的吸附，抑制指数分别为8和4；大黄、金钱草能直接灭活TGEV病毒，抑制指数均为8。【结论】 黄芩、黄芪、大黄、金钱草体外对TGEV均有抑制作用。

中草药；抗病毒；细胞病变；MTT法

猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为特征的高度接触性、急性胃肠道传染病。TGEV属于冠状病毒属的RNA病毒，与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、人SARS冠状病毒(SARS-CoV)等有较高的同源性。某些化学药物虽对TGEV有一定的抑制作用，但同时对宿主细胞有一定的毒性，故迫切需要开发抗TGEV效果明显、副作用小、价格低廉的药物[1-3]。

用中草药抗TGEV病毒具有安全、低毒、高效、价廉等优势。龚国清等[4]研究表明，木犀草素能抑制TGEV吸附、复制，并可直接杀死病毒。雷用东等[5]研究表明，接骨木花色苷具有抗TGEV的作用。Lau等[6]研究表明，鱼腥草通过抑制3CLpro的活性及依赖RNA的RNA多聚酶活性，提高CD4+、CD8+数量，从而起到抗TGEV的作用。姜成刚等[7]研究显示，板蓝根、鱼腥草、败酱草体外均有抗TGEV的效果，且“鱼腥草+败酱草”组合抗病毒的效果既比单药强，也比其他组合的效果明显。Kim等[8]研究表明，黄连、升麻、苦楝皮、黄柏、苦参体外能抑制PEDV复制。甘草酸能抑制多种DNA、RNA病毒，具有抗SARS-CoV的活性[9]。肉桂的原花青素和丁醇提取物也具有抗SARS-CoV的作用[10]。由于TGEV和PEDV、SARS-CoV具有较高的核酸序列同源性，都是冠状病毒属的成员，因此在治疗上可以互相借鉴。甘肃省中草药资源丰富，为了筛选有效抗TGEV的药物，本试验挑选临床或相关试验证明有抗病毒活性的中草药黄芪、黄芩、大黄、金钱草，通过细胞病变抑制法结合MTT法体外检测这些药物的抗TGEV效果，以期为TGE的治疗提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒和细胞 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)株，为甘肃农业大学动物医学院微生物与免疫学教研室保存的疫苗分离株。PK-15细胞，由兰州兽医研究所提供。

1.1.2 试验药物 大黄、黄芪、黄芩、金钱草等，购自兰州安泰堂医药公司，由甘肃农业大学动物医学院杨致礼教授鉴定。

1.1.3 主要试剂 DMEM培养基、胰酶、胎牛血清和3-(4,6-二甲基噻唑-2-x1)-2,5-乙苯基-四唑溴盐(MTT)。细胞生长液为含体积分数10%胎牛血清(FBS)、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、50 μg/mL卡那霉素、pH 7.2的DMEM培养液；细胞维持液含体积分数2%胎牛血清，其他成分同细胞生长液。

1.1.4 主要仪器和设备 纯水仪，CO2恒温培养箱，倒置显微镜，96孔细胞培养板，酶标仪等。

1.2 方 法

1.2.1 TGEV的增殖及毒力测定 将1 mL TGEV毒液接种于PK-15细胞(3×106个/瓶)，37 ℃孵育1 h，向细胞培养瓶加入4 mL含体积分数2%胎牛血清(FBS)和5 μg/mL胰酶的DMEM，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱培养，每天观察细胞病变(CPE)。如果无明显CPE，则培养5 d后，将细胞反复冻融3次，5 000 r/min离心10 min后收获细胞上清再对PK-15细胞进行盲传，直至产生明显的CPE。将病变细胞反复冻融3次，收集病毒液置-70 ℃冰箱保存备用。用Reed-Muench法[11]计算病毒滴度。

1.2.2 中草药提取液的制备 中草药提取液采用传统的水提法制备。将一定质量的中草药用水洗净后，加入10倍体积的去离子水煎煮提取0.5 h，将提取液2 000 r/min离心5 min，去除可能存在的较大杂质，115 ℃高压灭菌20～30 min。药液终质量浓度控制在100 mg/mL(以生药计)，4 ℃贮存备用。

1.2.3 中草药提取液的稀释及安全质量浓度的测定 将中草药提取液用细胞维持液稀释成50，25，12.5，6.25和3.175 mg/mL备用。将PK-15细胞接种到96孔细胞培养板，待长成单层后，吸弃培养液，用细胞维持液洗一遍，试验孔分别加入各质量浓度药物100 μL，细胞对照组加细胞维持液100 μL，每个质量浓度重复4孔。将细胞培养板置湿盘，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养72 h，期间每天观察细胞形态及单层完好程度。与对照组细胞相比，细胞无形态改变且单层完整的最大药物质量浓度为受试药物的最大安全质量浓度(TC0)。

1.2.4 4味中草药抗TGEV试验 (1)对TGEV吸附细胞的阻断作用。将各稀释度的中草药(黄芪：50～3.13 mg/mL；黄芩、大黄、金钱草：6.25～0.39 mg/mL)0.1 mL分别加入到长满单层PK-15细胞的96孔细胞培养板上，每个质量浓度重复4孔，培养2 h，弃掉药物，用细胞维持液洗涤1次，各孔再加入0.1 mL TGEV病毒液(100 TCID50)，37 ℃孵育1 h，弃病毒液，补充细胞维持液继续培养96 h。试验同时设病毒对照组(只加病毒)和细胞对照组(只加细胞维持液)。

(2) 对TGEV的直接灭活作用。将0.1 mL各稀释度的中草药(黄芪：50～3.13 mg/mL；黄芩、大黄、金钱草：6.25～0.39 mg/mL)分别与等体积的TGEV病毒液(100 TCID50)混合作用2 h，然后将混合液加入长满单层PK-15细胞的96孔细胞培养板中，37 ℃吸附1 h，弃混合液，补充细胞维持液继续培养96 h，每个质量浓度重复4孔。试验同时设病毒对照组和细胞对照组。

1.2.5 结果观察 (1)中草药对TGEV致CPE的影响。对于上述处理的细胞每隔24 h在倒置显微镜下观察，比较药物处理组与病毒对照组细胞病变的差异，96 h后，能抑制TGEV产生CPE的中草药，进行下面的MTT试验。

(2)MTT试验。向96孔细胞培养板的各孔加入5 mg/mL的MTT 100 μL，37 ℃孵育4 h，小心地将每孔液体吸弃，再分别加入100 μL 酸化异丙醇，振荡器上振荡5 min，使沉淀完全溶解。使用酶标仪在波长630 nm测各孔的吸光值(OD630)，采用SPSS 12.0软件进行t检验，比较病毒对照组与加药组OD630的差异显著性，求出药物的最小有效质量浓度，以抑制指数为指标评定药效。

抑制指数=安全质量浓度/最小有效质量浓度。

2 结果与分析

2.1 TGEV致PK-15细胞CPE的形态学观察

正常的PK-15细胞形态为不规则的三角形(图1-A)。使用含体积分数2% FBS和5 μg/mL胰酶的DMEM培养基，TGEV在PK-15细胞盲传4代后开始产生CPE，表现为细胞变圆、聚堆，细胞多数脱落、崩解死亡(图1-B)。Reed-Muench法测得病毒滴度为10-2.5TCID50/0.1 mL。

图1 TGEV对PK-15细胞的致病变作用A.对照组PK-15细胞；B.TGEV感染48 h后的PK-15细胞

2.2 4味中草药最大安全质量浓度的确定

不同药物在不同质量浓度下对PK-15细胞的毒性不同。试验结果表明，黄芪在质量浓度为50 mg/mL时，PK-15细胞仍然长势良好，甚至超过了低质量浓度时的细胞状态，说明黄芪对PK-15细胞没有毒性，反而能促进细胞的生长。黄芩、大黄、金钱草的最大安全质量浓度分别为12.50，6.25和6.25 mg/mL。

2.3 4味中草药对TGEV致CPE的影响

药物与TGEV加入细胞作用后，每天观察药物对TGEV致CPE的影响，结果见图2。

图2 4味中草药对TGEV致PK-15细胞CPE的影响(×200) 药物和病毒作用后96 h在倒置显微镜下观察的细胞生长情况。A～D分别为50 mg/mL黄芪组、6.25 mg/mL黄芩组、病毒对照组和细胞对照组；E～H分别为6.25 mg/mL大黄组、6.25 mg/mL金钱草组、病毒对照组和细胞对照组

图2显示，黄芩与黄芪对TGEV吸附PK-15细胞有抑制作用(图2-A，B)，而病毒对照组细胞则出现CPE(图2-C)，正常的对照组细胞形态正常(图2-D)；大黄、金钱草对TGEV有直接灭活作用(图2-E，F)，而病毒对照组细胞有CPE出现(图2-G)，细胞对照组形态正常(图2-H)。

2.4 MTT法确定4味中草药抗TGEV的作用

2.4.1 对TGEV吸附PK-15细胞的抑制作用 表1和表2结果表明，黄芪和黄芩能抑制TGEV对PK-15细胞的吸附作用。黄芪在质量浓度不小于12.50 mg/mL时抗TGEV吸附的作用显著高于TGEV对照组，其抑制指数为4。与TGEV对照组相比，黄芩在质量浓度为6.25～3.13 mg/mL时，其抗TGEV吸附的作用极显著，在药物质量浓度为 1.56 mg/mL时抗吸附作用显著(表2)，其抑制指数为8。

表1 黄芪对TGEV吸附PK-15细胞的抑制作用Table 1 Inhibition of TGEV absorption on PK-15 cells by Astragalus

注：与TGEV对照组相比，数据后标*表示差异显著(P<0.05)，标**表示差异极显著(P<0. 01)。下同。

Note:Compared with TGEV control group,one asterisk (*) indicates the difference is significant (P<0.05),while two asterisks (**) indicate the difference is extremely significant (P<0. 01).The same below.

表2 黄芩对TGEV吸附PK-15细胞的抑制作用Table 2 Inhibition of TGEV absorption on PK-15 cells by Scutellaria

2.4.2 药物对病毒的直接灭活作用 大黄、金钱草有直接灭活病毒的作用。大黄在质量浓度为3.13～1.56 mg/mL时，其OD630极显著高于TGEV对照组(表3)，对TGEV的抑制指数为8。金钱草在质量浓度不小于0.78 mg/mL时，其灭活TGEV的作用极显著高于病毒对照组(表4)，对TGEV的抑制指数为8。

表3 大黄对TGEV的直接灭活作用Table 3 Direct destruction action of Rhubarb against TGEV

表4 金钱草对TGEV的直接灭活作用Table 4 Direct destruction action of Loosestrife against TGEV

3 讨 论

TGEV属于冠状病毒，该属病毒培养比较困难。一方面需要敏感的细胞，另一方面细胞培养液有时也需要特殊处理。Storz等[12]研究表明，胰酶能促进牛冠状病毒在胎牛脑(bovine fetal brain,BFB)细胞和胎牛甲状腺(bovine fetal brain,BFTy)细胞上蚀斑的形成及细胞的融合、裂解脱落。TGEV对猪睾丸细胞 (ST)和PK-15细胞比较敏感，且在细胞维持液里加入适量的胰酶有助于提高病毒效价，较早产生细胞病变。但是ST细胞难培养，对血清质量要求较高，因此选用PK-15细胞既降低了操作的难度，又可以节约一部分成本。本试验根据TGEV毒株的特性，选用了PK-15细胞，并在细胞维持液里加入了终质量浓度为5 μg/mL的胰酶，使细胞在第4代产生细胞病变。

体外组织培养法是体外筛选抗病毒中草药的主要方法，常用的检测方法有病毒致细胞病变抑制法、染料摄入法、MTT法、空斑减少法等。病毒致细胞病变抑制法比较直观，但无法进行统计学计算。所以本试验又结合了MTT法，可比较加药组和病毒对照组活细胞数量是否有显著差异，从而确定中草药是否发挥了抗病毒的效果。采用MTT法应注意的问题有：MTT应保存于-20 ℃，而且操作过程中需要避光，以免MTT分解；MTT在细胞中的作用时间不宜太长，一般为4 h；MTT作用后可采用二甲基亚砜(DMSO)溶解蓝色结晶，也可以用酸化异丙醇溶解，因为DMSO有一定毒性，而酸化异丙醇则没有，因此本试验选用酸化异丙醇，既起到良好的溶解结晶的作用，又降低了操作的危险性。

本试验研究了4味中药的体外抗病毒作用，结果显示，黄芩和黄芪对病毒有抗吸附作用，大黄、金钱草对TGEV有直接灭活作用。黄芩为唇形科植物黄芩的干燥根，具有抗菌、抗病毒、抗炎及抗肿瘤等功效，其有效成分是黄酮类化合物。研究表明，黄芩多糖能抑制鸡新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞[13]；Zandi等[14]报道黄芩苷可抑制登革热病毒的复制。黄芪的有效成分是黄芪多糖，可提高机体免疫力，增强宿主抗病毒能力。Kallon等[15]报道黄芪在体内外均可抑制H9N2禽流感病毒的感染；Jiang等[16]报道黄芪多糖可抑制鸡传染性法氏囊病毒的细胞感染。本试验结果也显示，黄芩和黄芪对TGEV的细胞感染有一定的抗吸附作用。大黄对多种DNA、RNA病毒都有抑制作用[17-18]。本试验结果表明大黄有直接杀灭TGEV的作用。金钱草，又名马蹄香，药典记载有“清热除湿，利尿通淋”的作用，其成分包括生物碱、黄酮苷类，用于治疗黄疸、尿赤、痈肿、疔疮、肝胆结石和尿路结石等症。金钱草可用于治疗人轮状病毒感染引起的腹泻[19]，也可用于犬细小病毒引起的肠炎的治疗[20]。但金钱草的抗TGEV病毒作用尚未见报道。本研究表明，金钱草能直接灭活TGEV，拓展了金钱草的应用范围。综上所述，黄芪和黄芩对TGEV有抑制吸附的作用，可以作为预防TGEV感染的候选药物使用；大黄、金钱草对TGEV有直接杀伤的作用，可以作为治疗TGEV的候选药物使用。

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Anti-TGEV effects of four herbs

WEI Wen-qiang1,2,WU Run1,LIU Lei1

(1CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu730070,China；2MedicalCollege,HenanUniversity,Kaifeng,Henan475004,China)

【Objective】 This study investigated the inhibition effects of four herbs (Astragalus,Scutellaria,Rhubarb and Loosestrife) against TGEVinvitro. 【Method】 The effective components of four herbs were extracted by traditional water-boiling method and their maximum safe concentrations for PK-15 cells were determined.The inhibition activity of four herbs against TGEV infection was determined by cytopathic effect method.The minimal antiviral concentrations and inhibition indexes of the four herbs were tested by MTT method.【Result】 The maximum safe concentrations of herbs Astragalus,Scutellaria,Rhubarb and Loosestrife were 50,12.50,6.25,and 6.25 mg/mL,respectively.Scutellaria and Astragalus inhibited the absorption of TGEV on PK-15 cells with the inhibition index of 8 and 4,respectively.Rhubarb and Loosestrife inactivated TGEV directly with the inhibition index of 8.【Conclusion】 Astragalus,Scutellaria,Rhubarb and Loosestrife all inhibited TGEVinvitro.

herb;antivirus;cytopathic effect;MTT assay

时间:2015-11-11 16:16

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.12.005

2014-03-20

甘肃省农业科技专项农业科技示范基地建设项目(0623006)

卫文强(1981-)，男，河南洛阳人，讲师，博士，主要从事微生物学研究。E-mail:greatdream123@163.com

刘 磊(1960-)，男，四川成都人，教授，博士，主要从事免疫学研究。E-mail:liuleigs@163.com

S858.283.72

A

1671-9387(2015)12-0023-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151111.1616.010.html