响应面法优化内生真菌发酵产紫杉醇工艺

程俊文，贺 亮，邹景泉*，方 茹，邱德有，胡传久，魏海龙，蒋云鹤，王衍彬

（1. 浙江省林业科学研究院，浙江省森林食品研究重点实验室，浙江 杭州 310023；2. 中国林业科学研究院林业研究所林木遗传育种国家重点实验室，北京 100091）

响应面法优化内生真菌发酵产紫杉醇工艺

程俊文1，贺 亮1，邹景泉1*，方 茹1，邱德有2，胡传久1，魏海龙1，蒋云鹤1，王衍彬1

（1. 浙江省林业科学研究院，浙江省森林食品研究重点实验室，浙江 杭州 310023；
2. 中国林业科学研究院林业研究所林木遗传育种国家重点实验室，北京 100091）

选择产紫杉醇的内生真菌EF-04和葡萄糖、豆饼粉、乙酸钠三种营养因子，在单因素试验的基础上，通过Box-Benhnken组合设计和响应曲面分析法优化内生真菌液体发酵产紫杉醇的发酵工艺条件进行紫杉醇人工生产试验。响应面分析结果表明，内生真菌液体发酵产紫杉醇的最佳培养条件为葡萄糖25.54g/L、豆饼粉7.94 g/L、乙酸钠5.64 g/L；此条件下的验证试验表明，实际紫杉醇得率为313.52 μg/L，与理论值基本吻合。

紫杉醇；内生真菌；发酵；Box-Behnken；响应面

紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是一种二萜类衍生物，是具有独特抗癌机制的天然产物，分子式为C47H51NO14，最初从红豆杉植物中分离得到[1]。经临床验证，具有良好的抗肿瘤作用，特别是对癌症发病率较高的卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效。紫杉醇是近年来国际市场上最热门的抗癌药物之一。随着地球人口癌发率的增长，对紫杉醇的需求量明显增大。目前临床和科研所需的紫杉醇主要是从红豆杉中直接提取。由于紫杉醇在植物体中含量极低，生产1 kg紫杉醇需要2 500棵左右成年红豆杉树木的原料，也因此造成了对红豆杉的大量砍伐，致使其天然资源趋于枯竭，造成了生物多样性和生态环境的极大破坏。

能合成紫杉醇的红豆杉内生真菌的发现, 是紫杉醇资源研究的重要进展。自从Stierle等[2]证明短叶红豆杉的内生真菌可以产生抗癌药物紫杉醇，对植物内生真菌的研究更加引人注目。我国学者也发现了多种产紫杉醇的内生真菌[3～5]。

植物内生菌是一种分布广、种类多、生物学功能多样的微生物资源库。在与宿主植物长期共进化过程中，内生菌可产生一系列具有抗肿瘤、抗病毒、免疫抑制等作用的生物活性。由于内生真菌生长迅速，易于进行大规模培养，培养所需的原料可以是来源广泛、价格低廉的农林副产物，因而利用内生真菌生物制备紫杉醇，被认为是破解紫杉醇来源的最有效的解决方法。

响应曲面法（response surface methodogy，RSM）是建立一个包括各因素的一次项、平方项和任何两个因素之间的一级交互作用项的数学模型。目前该方法已广泛用于发酵培养基优化、培养条件优化和酶解等生化反应优化和模型建立中[6～8]。本实验以紫杉醇为目标产物，利用Box-Behnken设计和响应面法优化发酵培养基组成来提高内生真菌发酵产紫杉醇的产量，为以后的发酵和放大实验奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

菌株来源：产紫杉醇的内生真菌EF-04，分离自南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei），本实验室保存。

1.2 培养基

1.2.1 斜面PDA 活化菌种用。

1.2.2 液体种子培养基 葡萄糖20 g/L、NH4NO35 g/L、蛋白胨5 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L。

《方案》特别指出，坚决治理校外培训机构的违法违规培训活动，净化外部环境，去除学前教育“小学化”的“外在推手”。未经教育部门批准，任何组织和个人不得以家教、咨询、文化传播、公益课堂等名义向学龄前儿童开展培训业务。严禁校外培训机构开设学前班、幼小衔接班以及其他形式的以学龄前儿童为培训对象的半日制或全日制培训班。禁止校外培训机构开展以语文、数学、英语等小学课程为内容的、面向学龄前儿童的培训活动。校外培训机构培训时间不得和幼儿园保育教育服务时间相冲突。严禁校外培训机构的宣传广告进入学校和幼儿园，禁止校外培训机构在学校和幼儿园大门口散发宣传广告。

1.2.3 摇瓶发酵基础培养基 葡萄糖20 g/L、NH4NO35 g/L、蛋白胨5 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L。

1.3 培养方法

1.3.1 斜面培养 从母种试管中切出蚕豆大小的菌丝块接种于斜面的中部，25℃培养10 d。

1.3.2 液体种子培养 将活化的斜面菌种切割成黄豆大小的菌丝块，接种于液体培养基中，500 mL三角瓶装培养基150 mL于25℃，120 r/min培养7 d。

1.3.3 发酵培养 采用二级摇瓶，500 mL三角瓶装液量150 mL，液体菌种接种量为10%，于25℃，120 r/min培养。1.4 响应面法实验设计

在单因素试验的基础上，选择葡萄糖、豆饼粉、乙酸钠3个因素，运用Box-Behnken中心组合试验设计原理[8～9]，采用3因素3水平的响应面设计，利用Design Expert 8.05软件对实验数据进行回归分析。自变量的试验水平分别以-1、0、1进行编码，试验因素及水平设计见表1。

表1 响应面分析因子及水平Table 1 Factors and levels of RSM

1.5 分析方法

1.5.1 菌丝干重测定 取100 mL发酵液，在3 000 r/min离心20 min，经自来水洗涤多次后，将菌丝体在105℃烘干至恒重，电子天平称重。

1.5.2 紫杉醇含量测定 发酵产物（包括菌丝体和发酵液）细胞超生破碎后的混合抽提物。HPLC色谱条件：色谱柱为Agilent EclipseXDB-C18柱（4.6 mm×150 mm），流动相为甲醇—水（65：35），检测波长为228 nm，流速为0.8 mL/min，柱温为35℃，进样量为20 μL[3]。

2 结果与分析

2.1 响应面分析方案及结果。

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，设计3因素3水平的响应面分析试验。共有17个试验点，其中12个为析因点，5个零点试验用以估计试验误差。以紫杉醇得率为响应值，试验方案及结果见表2。

2.2 回归模型建立及方差分析

利用Design Expert 8.05软件对表2实验数据进行分析[9]，获得紫杉醇得率对葡萄糖、豆饼粉和乙酸钠的多元二次回归方程：

Yield = 322.20＋3.21X1＋7.07X2＋22.95X3-3.87X1X2＋4.39X1X3-9.56X2X3-28.21X1X1-19.36X2X2-14.47X3X3

由表3方差分析可知，以紫杉醇含量为目标函数的回归方程的回归效果达到极显著水平，P值均＜0.000 1；模型的决定系数R2= 0.991 5，说明模型与实际实验拟合较好；校正决定系数Adj R2= 0.980 6，说明该模型能解释98.06 %响应值的变化；模型的失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率，表3中模型失拟项的P值为0.382 8，大于0.05，表明模型的失拟项不显著；根据表3的显著性分析结果，X2、X3、X1X1、X2X2、X3X3及X2X3的交互项对紫杉醇的合成均显著（p＜0.05）影响。综合以上表明这个模型建立的回归方程能运用于内生真菌液体发酵培养基优化的理论预测。

表3 回归模型方差分析Table 3 ANOVA on regression model

2.3 响应面图形分析

分别将模型中的葡萄糖、豆饼粉及乙酸钠的其中一个因素固定在0水平，得到另外两个因素的交互影响结果，二次回归方程的响应面及其等高线如图1、图2、图3所示，各个因素及其相互间的交互作用对响应值的影响结果通过该组图可以直观地反映出来。极值条件应该在等高线的圆心处。由几组图可以看出，影响内生真菌发酵产紫杉醇最显著的因素为乙酸钠（X3），表现为响应面变化弧度较大。葡萄糖（X1）响应面弧度变化平缓，说明对响应值影响相对较小。

此外，等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示二因素交互作用显著，而圆形则与之相反。从图1、图2、图3中可以看出，X1与X3、X2与X3交互作用显著；X1与X2无交互作用，表明一因素对响应值的影响规律并不会随着另一因素的改变而有明显变化。

2.4 验证实验

通过SAS软件对上述方程进行求解，得到最佳培养条件为：葡萄糖25.54 g/L，豆饼粉7.94 g/L，乙酸钠5.64 g/L，其紫杉醇产量理论值可达331.62 μg/L。

为检验模型预测值与实际实验值之间的相关性，即检验响应面优化模型的可靠性，对内生真菌在预测的最优发酵条件下紫杉醇产量进行实验验证。实验中葡萄糖、豆饼粉和乙酸钠的优化值分别为25.54、7.94、5.64 g/L，三组平行实验，测得紫杉醇得率分别为323.15、308.14、309.26 μg/L，实际紫杉醇得率平均值为313.52 μg/L，达到了回归模型预测理论值的94.54%，实验结果与模型符合良好，说明该模型能较好地模拟和预测紫杉醇产量。

图1 葡萄糖和豆饼粉交互影响紫杉醇得率的曲面图和等高线Figure 1 Response surface and contour of interaction of glucose and soybean powder on Taxol yield

图3 豆饼粉和乙酸钠交互影响紫杉醇得率的曲面图和等高线Figure 3 Response surface and contour of interaction of soybean powder and sodium acetate on Taxol yield

3 结论

本研究选择产紫杉醇的内生真菌EF-04和葡萄糖、豆饼粉、乙酸钠三种营养因子，根据Box-Benhnken中心组合实验设计及三因素三水平的响应面分析，通过二次多项回归模型进行方差分析和回归拟合，预测了内生真菌发酵产紫杉醇最佳培养基条件为：葡萄糖25.54 g/L，豆饼粉7.94 g/L，乙酸钠5.64 g/L，紫杉醇得率理论值可达331.62 μg/L。验证实验中紫杉醇实际得率为313.52 μg/L，与预测值十分接近，证明了该实验方法的稳定性。

[1] Wani M C, Taylor H L, Wall M E, et al. Plant antitumor agents. VI. The isolation and structure of Taxol, a novel antileukemic and antitumoragent from Taxus brevifolia[J]. J Am Chem Soc 1971, 93(9)： 2325-2327.

[2] Stierle A , Strobel G, Stierle D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of pacific yew[J]. Science, 1993, 260（5105）：214-216.

[3] 靳瑞，康冀川，文庭池，等. 一株产紫杉醇内生真菌液体发酵工艺的优化[J]. 菌物学报，2011（2）：235-241.

[4] 邱德有，黄美娟，方晓华，等. 一种云南红豆杉内生真菌的分离[J]. 真菌学报，1994，13（4）：314-316.

[5] 周东坡，孙剑秋，于寒颖，等. 中国一新记录属—多节孢属[J]. 菌物系统，2001，20（2）：148-149.

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[7] 王允祥，吕凤霞，陆兆新. 杯伞发酵培养基的响应曲面法优化研究[J]. 南京农业大学学报，2004，27（3）：89-94.

[8] Liang Renjie. Optimization of extraction process of Glycyrrhiza glabra polysaccharides by response surface methodology[J]. Carbohydr Polym，2008，74（4）：858-861.

[9] 费荣昌. 实验设计与数据处理（第四版）[M]. 无锡：江南大学出版社，2001.

Optimization of Fermentation Conditions for Taxol Production from Endophytic Fungus by Response Surface Methodology

CHENG Jun-wen1，HE Liang1，ZOU Jing-quan1，FANG Ru1，QIU De-you2，HU Chuan-jiu1，WEI Hai-long1，JIANG Yun-he1，WANG Yan-bin1

（1. Key Laboratory of Forest Food of Zhjiang, Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China; 2. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China）

Based on the results of single factor experiment, three levels and three factors of Box-Behnken design was employed combining with response surface methodology (RSM) to optimize the fermentation conditions for taxol production from endophytic fungus. The result showed that the optimal fermentation conditions were as follows: glucose 25.54 g/L, soybean powder7.94 g/L and sodium acetate 5.64g/L. Verification test demonstrated that the average yield of taxol was 313.52 μg/L, similar to theoretical value of 331.6 2μg/L.

taxol; endophytic fungus; fermentation; Box-Behnken; Response surface methodology (RSM)

S718.8

：B

1001-3776（2015）06-0068-05

2015-06-08；

2015-10-05

浙江省省院合作林业科技项目（2013SY17）；浙江省科技厅院所专项项目（2014F30001）；浙江省自然科学基金项目（LQ15C160001）;国家自然科学基金项目（31170628,31300567）、中央级公益性科研院所项目（RIF2014-01）的部分研究内容

程俊文（1981-），男，安徽省芜湖人，硕士，副研究员，从事森林食品及林源中药活性成分开发研究；*通讯作者。