牡丹籽油体外及对脂代谢紊乱大鼠体内抗氧化作用的研究

刘丛彬 宣自华 董振兴,2 彭代银

(安徽中医药大学现代中药安徽省工程技术研究中心 省部共建新安医学教育部重点实验室1，合肥 230038)(洛阳花瓣舞生物技术有限公司2，洛阳 471000)

牡丹籽油体外及对脂代谢紊乱大鼠体内抗氧化作用的研究

刘丛彬1宣自华1董振兴1,2彭代银1

(安徽中医药大学现代中药安徽省工程技术研究中心 省部共建新安医学教育部重点实验室1，合肥 230038)(洛阳花瓣舞生物技术有限公司2，洛阳 471000)

研究牡丹籽油的体外自由基清除率及对脂代谢紊乱大鼠体内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的酶比活力及丙二醛(MDA)含量的影响。采用α，α-二苯-β-苦味肼(DPPH·)法、[2，2-连氮-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐](ABTS)法计算自由基清除率(Inhibition percent, IP)；比色法测定脂代谢紊乱大鼠肝组织及血清SOD、GSH-Px酶比活力及MDA含量。牡丹籽油清除自由基能力与其浓度呈明显的量效(正比)关系。与模型对照组比较，中、高剂量组SOD、GSH-Px酶比活力显著提高，MDA含量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，表明牡丹籽油具有明显的体内外抗氧化作用。

牡丹籽油 自由基清除率 超氧化物歧化酶 谷胱甘肽过氧化物酶 丙二醛

牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)是毛茛科芍药属灌木，在我国各地广泛种植。自古以来皆用其根皮入药，名曰“丹皮”[1]。牡丹籽油系从牡丹籽仁提取的的金黄色透明油状液体，不饱和脂肪酸含量高达90%，其中亚麻酸占66.85%，亚油酸占23.34%及多种人体必须的活性成分[2-4]，具有降血脂、降胆固醇和促进脂肪代谢、增强免疫、预防冠心病等生理活性[5]，其现已列为我国新资源食品[6]。

近年来，牡丹籽油提取和开发的研究有大幅增加[5-8], 但对其功效学方面的研究鲜有报道，缺少试验数据。本试验所用牡丹籽油系通过牡丹籽脱壳后压榨，再经精炼而成。试验就牡丹籽油体内外抗氧化的功效学进行探索研究，为牡丹籽油可能作为心血管疾病的预防使用、辅助治疗及其食品安全性提供理论依据，在其开发应用方面提供参考。

1 材料

1.1 药物与试剂

牡丹籽油:洛阳花瓣舞生物技术有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号:20121210；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20121227；正己烷：上海润捷化学试剂有限公司，批号：20120730；过硫酸钾：国药集团化学试剂有限公司，批号：20120824。

1.2 实验动物

SPF级SD大鼠，雄性，8周龄，体质量(200±20) g，由安徽医科大学实验动物中心提供，实验动物饲养许可证号：皖动准字号SCXK2011-002；试验动物合格证号：No.3400020000136。本试验方案及实验动物的饲养与使用处置均通过安徽医科大学实验动物伦理委员会审批，并严格遵从委员会有关实验动物伦理关怀和规范进行。

1.3 仪器

GL20A全自动高速冷冻离心机：湖南仪器仪表总厂；FSH-2型可调高速匀浆器：江苏省金坛市容体仪器制造有限公司；UV-1600型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；MK3型酶标仪：美国赛默飞世尔公司。

2 试验方法

2.1 清除DPPH·法

分别取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL牡丹籽油于10 mL容量瓶中，用正己烷定容后混匀。再分别取1.0 mL至10 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，即得到牡丹籽油的系列浓度0.001、0.002、0.004、0.008、0.010 mL/mL；称取23.66 mg DPPH·用甲醇溶解并稀释至10 mL容量瓶中[9-11]，摇匀，作为储备液(6 mmol/L)，低温避光保存。用时取0.5 mL储备液置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成0.12 mmol/L的DPPH·溶液。样品加入比色皿中于517 nm处进行吸光度的测定，重复3次，取平均值。

2.2 清除ABTS+·法

取 25 mL 的7 mmol/L ABTS 溶液[9-10,12]和440 μL的140 mmol/L 过硫酸钾溶液混合，在室温下暗处反应 12～16 h 形成ABTS自由基阳离子储备液。低温避光保存。使用前用无水乙醇稀释制成工作液，在 734 nm 处的吸光值为 0.7±0.02。自由基工作液应现用现配。样品加入比色皿中于734 nm处进行吸光度的测定，重复3次，取平均值。

2.3 体内抗氧化试验方法

2.3.1 动物分组与给受试物方法

SD雄性大鼠60只，适应4 d后随机分成5组[9]，每组12只，即空白对照组(给予蒸馏水)、高脂饲料对照组(模型组)、高脂饲料+牡丹籽油高、中、低剂量(6.0、3.0、1.5 g/kg)组，每组10只。其中以人体推荐量[≤10 g/(d·人)]的5倍设定高剂量组牡丹籽油给受试物量。

高脂饲料由93.8%基础饲料、1%胆固醇、5%猪油、0.2%胆盐组成。给予高脂饲料的同时进行给受试物，给受试物体积为10 mL/kg，连续30 d，每天1次。每周称重1次，以调整给受试物量。空白、模型组大鼠给以等量的蒸馏水。

2.3.2检测指标与方法

末次给受试物结束后，3.5%水和氯醛腹腔注射大鼠麻醉，腹主动脉取血，4 ℃离心，4 000 r/min，10 min，取血清，置-20 ℃冰箱保存。取血后的大鼠颈椎脱臼处死，取肝脏，称重。将称重后的肝脏置于匀浆器中，加入冰生理盐水，研磨匀浆，静置，4 ℃离心，4 000 r/min，10 min,取上清液，制备10%的肝组织生理盐水匀浆，置-20 ℃冰箱保存，按试剂盒操作分别测定SOD、GSH-Px酶比活力及MDA的含量。

2.4 统计学分析

3 试验结果

3.1 体外抗氧化自由基清除率

采用体外清除DPPH·、ABTS+·体外抗氧化活性检测不同浓度牡丹籽油自由基清除率，随着牡丹籽油剂量的增大, 其自由基清除率也愈大, 表明清除自由基能力与浓度呈明显的量效关系，见表1。

表1 不同浓度牡丹籽油自由基清除率DPPH·及ABTS+·法检测结果

由表1可见，不同浓度样品对DPPH·与ABTS+·的测定结果与趋势均无显著性差异。

3.2 牡丹籽油对脂代谢紊乱大鼠血清、肝组织中SOD、GSH-Px水平的影响

与模型对照组相比，高、中、低剂量组大鼠肝组织中SOD、GSH-Px酶比活力明显提高(P<0.05；P<0.01)；与模型对照组相比，高、中剂量组大鼠血清中SOD、GSH-Px酶比活力明显提高；各给受试物组与空白对照组相比，SOD、GSH-Px酶比活力均无明显差异(P>0.05)，具有统计学意义，见表2。

表2 牡丹籽油对脂代谢紊乱大鼠肝组织、血清中SOD、GSH-Px酶比活力的影响

注：*P<0.05；**P<0.01,下同。

3.3 牡丹籽油对脂代谢紊乱大鼠血清、肝组织中MDA含量的影响

由表3可见，与模型对照组相比，高、中、低剂量组大鼠肝组织、血清中MDA含量明显降低(P<0.05；P<0.01)；各给受试物组与空白对照组相比，MDA含量差异无显著性(P>0.05)，具有统计学意义。

表3 牡丹籽油对脂代谢紊乱大鼠MDA含量的影响

4 讨论与结论

牡丹籽油的主要成分是亚油酸、油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸，其中亚油酸、亚麻酸是人体必需脂肪酸，其化学结构中含有多个不饱和化学键，在体外具有捕捉自由基的能力，结合氧化物成分，具有抗氧效果，在动物体内能促进胆固醇代谢，清除血管壁上的沉积物，对抗脂质代谢紊乱。研究发现，胆固醇必须与亚油酸结合后，才能在体内进行正常的运转和代谢。

通过体外自由基清除率试验表明，清除DPPH·测定结果与ABTS+·测定结果是一致的，且随着浓度的升高自由基清除率越高，也提示牡丹籽油具有一定的体外抗氧化能力；通过体内对脂代谢紊乱大鼠血清、肝组织中SOD、GSH-Px水平及MDA含量的测定，中、高剂量组与模型对照组相比SOD、GSH-Px酶比活力显著提高，MDA含量降低，且有显著性差异，进一步提示牡丹籽油具有体内的抗氧化能力。

高脂饮食可导致体内脂代谢紊乱，机体抗氧化能力下降，产生氧化应激。氧化应激使体内或细胞内活性氧的产生与抗氧化之间失衡，从而导致组织的损伤。高脂介导的脂质过氧化可产生大量自由基，攻击血浆游离脂肪酸中的不饱和脂肪酸，导致清除自由基能力减弱。过剩的自由基攻击生物膜系统中多不饱和脂肪酸、DNA、蛋白质和其他生物大分子，在不饱和键上不断产生快速的脂质过氧化作用，从而促进代谢性疾病的发生[13]。本试验结果说明牡丹籽油可以有效清除过量的自由基，对机体起到抗氧化作用。

自由基是生物体中生化反应的普遍中间介质或称非特异性调节剂。在正常生理情况下，活性氧的产生与清除可维持在一个有利无害的极低水平，但在衰老、应激、疾病情况下发生活性氧对重要生物分子的损伤，引起组织损害和器官退行性变化[14]。机体抗氧化防御体系中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和总抗氧化能力(T-AOC)对氧化与抗氧化平衡起着重要作用，可以有效阻断自由基引起的连锁反应，从而起到抗氧化、抗衰老作用[15]。因此，牡丹籽油作为具有清除自由基效能的外源性抗氧化剂，日益受到重视。

随着人们绿色环保消费意识增强以及化学合成抗氧剂毒害作用的发现，寻找并研究具有抗氧化活性的天然成分日益成为热点[16]。牡丹籽油较其他植物油脂具有更多营养成分和特性，具有降低胆固醇，调节血脂以及天然抗氧化功能，已逐渐被人们关注，被应用于食品、保健、医药和化妆品等领域[7]。

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Antioxidation of Peony Seed Oil in Vitro and The Disorder of Lipid Metabolism in Rats

Liu Congbin1Xuan Zihua1Dong Zhenxing1,2Peng Daiyin1
(Anhui University of Chinese Medicine, Project Technology Research Center in Anhui Province for Modern TCM, Key Laboratory of Xin'an Medicine, Ministry of Education1,Hefei 230038)(Luoyang Petals Dance Biotechnology Co.Ltd.2,Luoyang 471000)

To study the pharmacodynamics function of Peony seed oil on the clearance rate of free radicals in vivo and the influence on superoxide dismutase (SOD), glutathione-peroxidase (GSH-px) activity and malondialdehyde (MDA) content in vitro of the disorder of lipid metabolism in rats. Methods calculate the inhibition percent (IP) of free radical with DPPH and ABTS methods. Detected SOD, GSH-Px specific activity and MDA content in liver homogenate and serum by colorimetric method. Results with the peony seed oil, the free radical-scavenging rose in a dose-dependent manner. Compared with those of the blank control group ,SOD,GSH-Px specific activity of medium and high dose groups were markedly enhanced while the content of MDA were reduced significantly and the differences had statistical significance (P<0.05) . In conclusion, there is an antioxidative effect of peony seed oil in vitro and vivo obviously.

peony seed oil, clearance rate of free radicals,SOD, GSH-Px, MDA

TQ432.2

A

1003-0174(2014)06-0053-04

2013-07-05

刘丛彬，男，1975年出生，讲师，中药及复方的药理药效

彭代银，男，1963年出生，教授，中药及复方的药理药效