黄土高原地区酿酒葡萄果实多酚物质及抗氧化活性分析*

蒋宝，罗美娟，张振文

1(渭南职业技术学院，陕西渭南，714000)

2(西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌，712100)

作为酿造葡萄酒的基本原料，葡萄的品质决定着葡萄酒质量的优劣。目前，评价酿酒葡萄果实品质的指标，除常用的总糖、滴定酸、糖酸比和pH值等外，多酚物质也是重要指标之一。多酚作为葡萄果实中一类重要的次生代谢物质，其组成和含量通过影响葡萄原料而进一步影响相应葡萄酒的感官特征，如葡萄酒的色泽、收敛性、苦味和香气等。此外，这类次生代谢物质还具有重要的保健功能，能减少人体慢性疾病和冠心病的发病率，增强人体的抗氧化损伤能力［1－2］。经研究证实，葡萄酒的抗氧化能力主要取决于其所含有的多酚类物质［3－5］。

葡萄果实中的多酚通常分为黄酮醇、黄烷醇、花色苷、酚酸和萜烯类物质等5大类。然而，即使对于同一葡萄品种而言，葡萄果实中多酚物质的种类和含量因生态条件、栽培方式等不同而有不同程度的差异［6］，从而最终影响到葡萄酒的质量。研究葡萄果实(酿酒原料)中多酚物质的种类及其含量，对科学评价葡萄原料和葡萄酒质量及酿酒工艺的实施具有重要的理论与实际意义。

山西省乡宁县地处晋西黄土高原地区，以其具备发展葡萄产业独特的气候条件和地域特点被业内专家公认为葡萄栽培的优生区，但该地区葡萄果实中多酚物质及抗氧化活性的研究尚属空白。为此，本研究选取该地区主栽酿酒葡萄品种蛇龙珠(Cabernet Gernischt)和霞多丽(Chardonnay)，通过光谱和色谱分析，对其葡萄果实中的多酚物质组成、含量及抗氧化活性进行评价，以期为黄土高原地区葡萄酒产业的进一步发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试品种为蛇龙珠和霞多丽，根据葡萄果实的糖酸比值确定其最佳技术成熟度，并于2010年10月前后采收葡萄。2个品种的葡萄果实均采自山西省乡宁地区(戎子酒庄)且具有代表性的葡萄园。2个品种于2007年定植，均为实生根系，株行距为1.0 m×2.5 m、多主蔓扇形整枝，所有试验点栽培管理措施完全相同，用GPS测定葡萄园的海拔及经纬度(见表1)。

1.2 实验试剂

葡萄糖、酒石酸、没食子酸、NaNO2和AlCl3等，购自天津市博迪化工有限公司;甲醇、甲酸、乙腈、乙酸均为色谱纯，购于 Fisher(Fairlawn，NJ，USA)公司;标样儿茶素((+)-catechin)、槲皮素(quercetin)、白藜芦醇(trans-resveratrol)、没食子酸(gallic acid)和咖啡酸(caffeic acid)及二甲氨基肉桂醛(p-DMACA)、2，2-二苯代苦味酞基苯肼(DPPH)和水溶性维生素E(Trolox)，均购自Sigma-Aldrich公司。

1.3 主要仪器设备

UV-1800紫外可见光分光光度计，日本岛津公司;Eppendorf 5804R低温冷冻离心机，德国Eppendorf公司;Agilent 1200高效液相色谱仪-质谱(HPLCMS)，美国Agilent公司。

1.4 样品采集与提取液制备

采用“S”形取样法采集葡萄，将所采果实样品分为2份，1份直接破碎取汁，用于果实总糖、总酸和pH值的测定;另1份葡萄果实用液氮冷冻后研磨成粉末，再用酸化甲醇［V(体积分数60%甲醇)∶V(盐酸)=100∶0.1］重复提取3次，所有试验步骤均在避光条件下进行［7］，提取液置于－40℃超低温冰箱中用于酚类物质及抗氧化活性的测定。

1.5 测定项目及方法

1.5.1 基本理化指标的测定

总糖(以葡萄糖计)采用斐林试剂滴定法测定;总酸(以酒石酸计)用指示剂法(国标法)测定;pH值用酸度计法测定;单宁用福林-丹尼斯法测定［8］。

1.5.2 葡萄酒中酚类物质的测定

总酚含量采用福林-肖卡法［9］测定，结果以每千克果实中含有的没食子酸表示;总类黄酮的含量采用NaNO2-AlCl3法［10］测定，总黄烷醇的含量采用DMACA法［11－12］测定，结果均以每千克果实中含有的儿茶素表示;总花色苷的含量采用pH值示差法［13］测定，结果以每千克果实中含有的二甲花翠素-3-葡萄糖苷表示。

1.5.3 葡萄酒抗氧化能力的测定

DPPH自由基清除能力的测定参考Brandwilliams等［14］的方法，铜离子还原能力的测定参考 Apak等［15］的方法，结果均以每千克葡萄果实中所含的Trolox表示。

1.5.4 葡萄果皮中非花色苷酚类物质的测定

葡萄果实中单体酚的定性和定量分析在中国农业大学食品科学与工程学院葡萄与葡萄酒研究中心完成。利用HPLC-MS/MS技术，结合离子的保留时间来进行定性分析［16］。分别以儿茶素、槲皮素、没食子酸、咖啡酸和白藜芦醇作为黄烷醇类、黄酮醇类、羟基苯甲酸类、羟基肉桂酸和萜烯类物质的标准物，并利用外标法结合标准曲线的方法进行定量计算。

1.6 数据分析

采用SPSS16.0分析软件对实验数据进行分析，非花色苷酚类物质的测定重复测定2次，结果以2次测定的均值表示，其他指标均重复测定3次。

2 结果与讨论

2.1 葡萄果实理化指标的分析

乡宁产区位于晋西黄土高原地区，平均海拔1 050～1 100 m，四季分明，属于典型的大陆性季风气候。该产区1月份(最冷月)平均气温－6℃，年平均气温9.9℃，≥10℃有效积温2 998℃，较高的海拔为葡萄的生长提供了充足的光照和较大的昼夜温差。

表1 葡萄果实的基本理化指标Table 1 The physical and chemical index of grape berries

由表1可以看出，2010年该产区蛇龙珠和霞多丽果实的总糖含量分别为196.5和185.3 g/L，相应的糖酸比分别为18.9和21.3。查阅当地气象资料，2009和2010年该产区7～9月份总降雨量分别为213.6和290.4 mm，2010年比上一年降雨量增加了26.4%，葡萄成熟期间过量的降水在一定程度上限制了果实的成熟度。尽管如此，2个品种在2010年果实的总糖含量均已接近200 g/L，糖酸比接近或超过20，表明其成熟度均良好。

2.2 葡萄果实多酚含量及抗氧化活性的分析

酚类物质含量丰富的葡萄原料是酿造高品质葡萄酒的重要条件。由表2可以看出，红色品种蛇龙珠果实中单宁、总酚、总类黄酮和总黄烷醇等的含量均高于白色品种霞多丽，这与前人研究结果一致［17］，所以由红色品种的葡萄原料酿造的葡萄酒具有更强的健康属性。

蛇龙珠和霞多丽果实的总酚含量分别为2 598.3和1 380.0 mg/kg，均明显低于蒋宝等［18］在同等条件下对该产区赤霞珠果实总酚含量的研究(赤霞珠为3 445 mg/kg)，究其原因可能在于品种不同所致;此外，该产区霞多丽果实总酚含量明显低于王睿等［19］在同等条件下对烟台产区的研究结果，说明温度和降雨量对葡萄果实品质的影响不可忽视。类黄酮物质是葡萄果实和葡萄酒中含量最高、成分较为复杂的一类多酚物质，也是与葡萄酒感官质量关系最为密切的物质。由表2可知，蛇龙珠和霞多丽果实中总类黄酮含量分别为2 092.4和1 104.6 mg/kg，后者的含量约为前者的50%。黄烷醇对葡萄酒的收敛性具有重要作用，目前公认的具有明显抗氧化活性的儿茶素就属于此类。本研究中，蛇龙珠和霞多丽果实的总黄烷醇含量分别为473.1和169.4 mg/kg。其中，蛇龙珠果实的总黄烷醇含量高出同等条件下该产区赤霞珠果实25%以上［18］，研究表明总酚含量高的葡萄果实，其总黄烷醇含量未必也高。葡萄酒中的花色苷物质主要源于葡萄果皮，故白色霞多丽品种的果实中几乎不含有花色苷。花色苷作为葡萄果皮中的呈色物质，其含量主要取决于品种，但生态条件对果皮中花色苷物质的代谢合成能产生重要影响。本研究中，蛇龙珠果实的花色苷含量为1 591.9 mg/kg。通常高海拔、强光、低温及较大的昼夜温差均有利于果皮中花色苷的不断积累［20］。

表2 葡萄果实的酚类物质含量及抗氧化活性Table 2 Total amount of polyphenolic substances and antioxidant activity of grape berries

2种抗氧化指标的测定结果均表明，蛇龙珠果实的抗氧化活性强于霞多丽，这与蛇龙珠果实含有较高的多酚物质相对应，再次证明葡萄的抗氧化能力主要取决于其所含有的多酚类物质。在DPPH法测定中，蛇龙珠和霞多丽果实的抗氧化能力分别为9 955.7和5 446.1 μmol/kg，前者高出后者45.3%;在 CUPRAC法测定中，蛇龙珠和霞多丽果实的抗氧化能力分别为35 345.2和13 061.4 μmol/kg，前者高出后者63.0%，所以选用的抗氧化测定方法不同，导致测定结果的差异程度不尽相同。

生物体中存在多个抗氧化系统，如抗氧化酶系统、激素和多酚等，它们的工作原理及彼此间的关系尚不清楚［21］。同时，在生物体内存在多种自由基和抗氧化剂资源，它们各自都有不同的物理和化学特征，因此生物体抗氧化活性的评定是件十分复杂的工作，通常需要将2种以上且抗氧化机理不同的方法结合起来，并对选用方法进行优化以此来提高测定结果的客观性。本研究选用了2种方法，测定结果进一步证实了不同方法间的协同性与差异性。

图1 葡萄果皮的非花色苷酚类液相色谱图Fig.1 The HPLC analysis of grape skins non-anthocyanins phenolics

2.3 葡萄果实非花色苷单体酚的分析

葡萄酒中多酚物质的组成首先取决于酿酒原料(葡萄果实)，其次受酿造工艺和陈酿条件的影响。Downey等［20］的研究表明，品种和生态环境不同程度地对葡萄果实中类黄酮物质的生物合成产生影响。为进一步探究该产区蛇龙珠和霞多丽原料中多酚类物质的组成和含量，本实验通过高效液相色谱法(HPLC-ESI-MS/MS)在2个品种中分别检测出25和12种非花色苷酚类物质，其中包括6种黄烷醇、13种黄酮醇、5种羟基苯甲酸和1种羟基肉桂酸物质。色谱图见图1。

由表3可知，蛇龙珠和霞多丽果实中黄烷醇总量分别为617.8和165.8 mg/kg，且棓儿茶素和表儿茶素仅在蛇龙珠中被检测出。2个品种的儿茶素含量分别为88.3和42.1 mg/kg，蛇龙珠高出霞多丽约50%，这可能是其具有较强抗氧化活性的重要原因。黄酮醇是一类黄颜色的物质，它们可以保护植物免受紫外线辐射［22］。由表3可知，蛇龙珠和霞多丽果实中分别检测出13和6种黄酮醇，且彼此间组成和含量均差异较大。在霞多丽果实中检出的6种黄酮醇，包括4种槲皮素和2种山奈酚。除品种因素外，Price等［23］的研究还表明，光照强度与葡萄果实中黄酮醇的含量存在正相关性。葡萄果实中含有羟基苯甲酸和羟基肉桂酸2类酚酸。在蛇龙珠和霞多丽果实中分别检测出6和2种酚酸，后者中的酚酸包括香草酸己糖酯和反式-肉桂酸，它们的含量分别为6.6和1.3 mg/kg。由于本研究所用实验原料的生态条件和田间管理措施完全相同，所以表3中蛇龙珠和霞多丽果实在非花色苷酚类物质组成和含量上的差异主要是由于品种因素的不同所造成的。

3 结论

(1)红色品种蛇龙珠果实中的总酚、总类黄酮、总黄烷醇和总花色苷均不同程度地高于白色品种霞多丽，所以由红色品种葡萄原料酿造的葡萄酒具有更强的健康属性。

(2)DPPH法和CUPRAC法的测定结果均表明:蛇龙珠果实的抗氧化能力高于霞多丽品种，但因选用方法的不同，导致测定结果在不同方法间存在协同性与差异性。

(3)品种因素对蛇龙珠和霞多丽果实中非花色苷单体酚物质的组成和含量造成不同程度的影响，尤其是儿茶素含量前者是后者的2倍。

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