应用ISSR 技术鉴定杭白菊对叶斑病的抗性

郭庆海， 李丹霞， 王康才， 薛友荣， 周雪松， 陈志祥

(1.江苏省滨海县植保植检所，江苏 滨海224500;2.南京农业大学园艺学院，江苏 南京210095;3.江苏省滨海县农业科学研究所，江苏 滨海224500;4.江苏省射阳县盛大药材有限公司，江苏 盐城224300)

杭菊花是中国传统的药食兼用药用植物，随着人们生活水平提高，保健意识加强，其市场需求逐年增加，种植面积也随之扩大，但在老产区调查发现，由于连作，菊花病害尤其是菊花叶斑病等病害成为限制农民增产增收的障碍［1］。病害的判断诊治主要靠常规手段，用分子手段进行病害的鉴定分类则较少，张欣［2］应用RAPD 技术区别芒果抗炭疽病品种，李海生［3］利用ISSR 分子标记技术进行了植物遗传多样性的分析应用，高山等以ITS1 和ITS4 为 引 物扩增病原菌的ITS 片段，对叶斑病进行分子鉴定［4］。张正光等进行ITS 序列分析确定了根腐病的病原菌［5］。ISSR 简单序列重复区间(Inter-simple sequence repeat，ISSR )是一种基于微卫星(Simple sequence repeat，SSR)序列发展起来的、利用PCR 扩增进行检测的、十分有效的分子标记技术，广泛应用于植物遗传关系及遗传多样性、品种鉴定、系统演化等方面研究。作为一种新型的分子标记，ISSR 标记结合了RAPD 和SSR 的优点，具有模版需要量少，多态性丰富，无需试剂盒，结果记录方便，试验成本低，操作简单，实验稳定性较高等优点，但目前未见利用ISSR 技术鉴别菊花抗叶斑病品种的相关报道。为此，本试验采用ISSR 技术对20 个杭白菊材料(其中10 个材料为抗病材料)的抗病性育成品种的早期确定、抗病品种的鉴定及抗病机理等进行研究，以期为菊花抗叶斑病品种筛选、品种鉴定提供一种有效的辅助手段。

1 材料与方法

1.1 材料

20 种材料采自南京农业大学园艺学院实验基地，均为江苏省滨海县植保植检所菊花课题组前期选育，由南京农业大学中药材系王康才教授鉴定。品种名、田间抗性见表1。试验材料包括杭白菊的2个品系新白品系(新白)和红心品系(其他19 个品种)，其中新×香、红心11×香菊和红心11×菊花脑3个材料为杂交材料。

1.2 方法

采用改良的CTAB 法提取菊花基因组DNA［6］，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量和浓度，稀释至50 ng/μl。ISSR-PCR 反应体系总体积为20 μl，其中包括200.0 μmol/L dNTP、0.5 μmol/L primer、10×PCR buffer、50 ng DNA template、1.5 U DNA polymerase、无菌水。PCR 扩增反应在BIO-RAD 公司MJ Mini 48 孔梯度PCR 仪上进行。扩增程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s，45 ～55 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，39 个循环;72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。扩增后每管加入6×溴酚蓝1 μl，混匀后取10 μl 扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶中含有1% 的4S Green。电泳缓冲液为1×TAE，电压5 V/cm。在上海培青科技有限公司生产的JS-380 型凝胶成像系统上观测并照相。

表1 试验材料及其田间抗性Table 1 Accessions used in the study and their field resistance

1.3 数据统计及分析

根据PCR 扩增产物的电泳结果，在凝胶的某个相同迁移位置上有DNA 条带的记为1，无DNA 条带的记为0，采用POPGENE32 软件计算多态位点百分率(PPB)、平均有效等位基因数(Effective number of alleles，Ne)、Nei’s 基因多样性指数(Nei’s gene diversity，He)和 Shannon 信 息 多 样 性 指 数(Shannon’s information index，I);用DPS 分析软件的非加权配对类平均法(UPGMA)进行聚类分析。

2 结果

2.1 DNA 提取、引物筛选及多态性分析

提取并纯化材料DNA，琼脂糖凝胶电泳确定DNA。

利用3 个表型差异大的材料对100 条ISSR 引物进行筛选，确定23 条带型清晰、多态性较好的引物对20 个试验材料进行多态性分析。淘汰扩增效果差、带型模糊、对个别材料扩增不出条带的引物，最终筛选出10 条引物用于20 份材料的遗传分析。共扩增出168 条清晰可辨谱带，其中多态性带135条;平均多态位点百分率为80.36%，多态性较高。扩增条带集中在200 ～2 000 bp(表2)。如表2 所示在综合比较各引物扩增效果后发现165 号引物多态性条带百分率达100.00%，故选取165 号引物作为最理想的引物。图1 为ISSR 引物165 的扩增结果。

表2 有效ISSR 引物序列及其多态性Table 2 Efficient ISSR primer sequences and their polymorphisms

图1 ISSR 引物165 对供试材料的PCR 扩增图谱Fig.1 PCR amplified pattern of Dendranthema morifolium with ISSR 165

2.2 20 个菊花品种ISSR 遗产多样性分析

平均有效等位基因数(Ne)和Nei’s 基因多样性指数(Nei’s gene diversity，He)是衡量遗传变异最常用的2 个遗传指标，具有明显的遗传学意义［6］。Shannon 信息指数方便与同类研究进行比较［7］。利用软件包POPGENE32 对各位点的Ne、He以及Shannon 信息指数进行计算，结果显示，20 个品种平均有效等位基因数为1.549 1，平均Nei’s 基因多样性 指 数 为0.312 9，平 均 Shannon 信 息 指 数为0.458 8。本研究扩增的ISSR 片段多态性较高，说明在进化过程中，菊花栽培品种在DNA 分子水平上形成并保持了较高的遗传变异，还可能与菊花品种存在自交不亲和性［8-9］及无性繁殖有关。

2.3 菊花对叶斑病抗性与其ISSR 聚类组的相关性分析

由图2 可以看出，以遗传距离为0.38 处划分，20 个菊花品种聚类为3 个ISSR 组:第1 组包括大花2 号、大花4 号、优单4 号、优单6 号、红心9 号、红心13 号、红心19 号、红心1 号、红心20 号、单瓣2号，这一组均是高感、中感品种;第2 组包括NJK1、NJK2、NJK3、似贡3 号、红心11 号、新×香、红心11×香、红心11×脑、NJK4，具有抗叶斑病的品种都聚在这一类;第3 组只有一个品种，是新白。

图2 20 个菊花品种ISSR 标记的UPGMA 聚类图Fig.2 Dendrogram of 20 Dendranthema morifolium cultivars based on ISSR markers by UPGMA

对20 种菊花材料运用POPGENE 软件进行分析，结果(表3)显示，在20 种菊花材料中，H最大值为0.498 7，最小值为0.05;I最大值为0.693 1，最小值为0.119 3。这些结果显示出试验材料存在着丰富的遗传变异，推测与菊花长期的自然杂交、自然选择和人工选育造成的复杂的遗传背景有关，这说明菊花具有极其丰富品种的分子基础。在分成2 个类群的基础上，比较抗性材料与感病材料可知:抗性材料的Ne、H及I值均高于感病材料，说明抗性材料之间比易感病材料之间基因差异显著，抗性材料的遗传多样性比感病材料高。

表3 POPGENE 软件分析结果Table 3 The results analyzed by POPGENE software

从ISSR 标记聚类结果来看，聚类结果与杭菊花对叶斑病的田间抗性有明显的相关性，基本能够区分抗性品种和易感品种。

3 讨论

从ISSR 标记聚类结果来看，聚类结果与菊花对叶斑病的田间抗性有明显的相关性。所有抗性材料除了新白全部聚为抗叶斑病品种，除此之外，3 个杂交品种也聚到这一大组中，这个结果也说明了杂交技术在培育抗病新品种中的优势［10］，而所有易感病材料聚为高感、中感品种。新白是另一个品系的品种，在这里单独聚为一类。

对易感和具有抗性的2 组试验材料统计的结果显示，抗性材料的平均有效等位基因数、平均Nei’s基因多样性指数及Shannon 信息指数均高于感病材料，表明抗性材料的遗传多样性比感病材料高。可能是因为抗性的遗传多样性丰富，包括的抗病基因相对感病组较多，所以具有抗病性，其具体抗病基因位点仍需要继续研究。本研究因时间和条件限制仅应用ISSR 技术对菊花抗叶斑病进行鉴定，是否可以应用ISSR 技术鉴定菊花甚至其他植物的其他病害仍需继续研究。

ISSR 标记聚类结果表明，利用ISSR 技术可以鉴定菊花是否抗叶斑病，该技术可以作为早期筛选抗叶斑病品种的辅助手段。

［1］ 陈长军，刘德辉，王康才.江苏省药用菊花病害普查［R］.沈阳:第六届中国植物病害化学防治学术研讨会，2008.

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